细胞NADPH氧化酶活性光度法定量检测试剂盒产品使用说明书
主要用途
YIJI细胞NADPH氧化酶活性光度法定量检测试剂是一种旨在使用特异性抑制剂，通过反应系统测定样品中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化后峰值的降低，即采用光度法测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种细胞样品（动物或人体）还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH氧化酶）的特异活性检测。用于免疫、血液研究、蛋白组学、病理生理学等研究。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。
技术背景
NADPH氧化酶，通常称为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase；NADPH oxidase；EC1.6.3.1）或还原型辅酶II氧化酶，是机体防御机制中的重要元素。NADPH氧化酶由6个亚体构成：Rho GTP酶（Rho guanosine triphosphatase）和5个phox（吞噬细胞氧化酶；phagocytic oxidase）。其中主要包含细胞膜嵌合蛋白质分子（gp91phox、p22phox、flavocytochrome b558等），以及位在细胞质内的蛋白质分子（p47phox、p67phox、p40phox、Rac1、Rac2等）。其最特征性的酶活性是超氧化物歧化酶敏感的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶。细胞膜上的NADPH氧化酶被激活，将还原型辅酶Ⅱ（NADPH）转变为氧化型辅酶Ⅱ（NADP），氧分子则获得电子形成超氧阴离子O2-，由O2-又可生成H2O2和OH－。其超氧阴离子产物具有杀死微生物的功能。NADPH氧化酶异常将导致慢性肉芽肿病（Chronic Granulomatous Disease；CGD）。基于底物还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），在特异性抑制剂联苯基三价碘（diphenyleneiodonium；DPI）的存在下，受到NADPH氧化酶的催化作用，转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP），产生吸光峰值的变化，通过分光光度仪（340nm波长）检测，来测定NADPH氧化酶的特异活性。其反应方式为：
产品内容
YIJI清理液（Reagent A） 毫升
YIJI裂解液（Reagent B） 毫升
YIJI缓冲液（Reagent C） 毫升
YIJI反应液（Reagent D） 毫升
YIJI阴性液（Reagent E） 毫升
YIJI底物液（Reagent F） 微升
YIJI专性液（Reagent G） 微升
产品说明书 1份
保存方式
保存YIJI清理液（Reagent A）和YIJI阴性液（Reagent E）在4℃冰箱里，其余的保存在在－20℃冰箱里，避免反复冻融；YIJI反应液（Reagent D）和YIJI底物液（Reagent F），避免光照，有效保证6月
用户自备
15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
1.5毫升离心管：用于样品操作和保存的容器
细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离
4℃（微型）台式离心机：用于样品处理
恒温培养箱或恒温水槽：用于反应物孵育
比色皿：用于光度测定的容器
分光光度仪：用于光度分析
实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；YIJI反应液（Reagent D）和YIJI底物液（Reagent F）注意避光。然后进行下列操作。
一、样品准备
准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 106细胞）
小心加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），覆盖生长表面
小心抽去清理液
使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）
加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），混匀细胞
移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
小心抽去上清液
加入xx微升YIJI裂解液（Reagent B），充分混匀
转移到预冷的1.5毫升离心管
强力涡旋震荡15秒
置于冰槽里孵育30分钟
放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－YIJI 30030.1）
即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、测定准备
从-70℃取出待测样品（例如细胞裂解悬液样品等），置于冰槽里
设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为340nm，间隔60秒，读数6次（共5分钟），并置零
YIJI缓冲液（Reagent C）室温预热
背景对照测定
样品总活性测定
移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
加入xx微升YIJI反应液（Reagent D）
加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
放进30℃培养箱里静置3分钟
加入xx微升YIJI阴性液（Reagent E）
上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
即刻放入分光光度仪检测，此为背景空对照：（340波长读数）0分钟－（340读数）5分钟
移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
加入xx微升YIJI反应液（Reagent D）
加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
放进30℃培养箱里静置3分钟
加入100微升待测样品（注意：50至100微克细胞裂解悬液蛋白；样品须溶解；参见注意事项5、11和12）
上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
即刻放入分光光度仪检测，此为样品总活性读数：（340波长读数）0分钟－（340读数）5分钟
准备1个1.5毫升离心管
加入xx微升YIJI专性液（Reagent G）
加入100微升待测样品（注意：50至100微克细胞裂解悬液蛋白；样品须溶解；参见注意事项5、11和12）
放进30℃培养箱里静置5分钟
放进冰槽里备用
移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
加入xx微升YIJI反应液（Reagent D）
加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
放进30℃培养箱里静置3分钟
加入上述冰槽里的xx微升含有YIJI专性液（Reagent G）和待测样品的溶液
上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
即刻放入分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数：（340波长读数）0分钟－（340读数）5分钟
样品非特异活性测定
计算样品活性
1）样品总活性和非特异活性
2）样品特异活性
注意事项
本产品为21次（10个样本）操作，包括1次背景对照测定
操作时，须戴手套
YIJI反应液（Reagent D）和YIJI底物液（Reagent F）注意避光
系统操作过程中，背景测定只需1次
样品检测前，须溶解和澄清
加样后3秒内进行光度测定
光度测定后，比色皿须清洗彻底
样品0秒读数通常和背景空对照0秒读数一致
反应测定值由高到低变化；测定持续5分钟
测定值由高到低变化，表明有酶活性
建议待测样本蛋白浓度为50至100微克/100微升；如果样本酶活性过低，则可以增加样本量（本公司提供YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）
如果使用纯化目标蛋白，则蛋白浓度为1至5微克/100微升；如果使用纯化膜蛋白，则蛋白浓度为10微克/100微升
样品实际活性是指联苯基三价碘（diphenyleneiodonium；DPI）敏感的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，去除其它干扰因素
NADPH氧化酶活性单位浓度定义：在30℃室温下，pH 7.0的情况下，每单位酶在单位时间内（每分钟）氧化1微摩尔的还原型辅酶Ⅱ（NADPH）
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