细胞诱导型一氧化氮合成酶活性比色法定量检测试剂盒使用说明
主要用途
YIJI细胞诱导型巨噬细胞一氧化氮合成酶（iNOS /NOS2/mNOS）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过诱导型一氧化氮合成酶、硝酸还原酶和乳酸脱氢酶反应系统，在诱导型一氧化氮合成酶特异性抑制剂存在与否的情况下，由底物L-精氨酸被催化产生一氧化氮，再转化为亚硝酸，然后使用Griess试剂，得到紫红或粉红色偶氮化合物产物，通过观察其吸光峰值的变化，即采用比色法来测定细胞样品中诱导型一氧化氮合成酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解悬液样品（动物、人体、昆虫等）的诱导型一氧化氮合成酶的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，重复性好。
技术背景
一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase；NOS；EC1.14.13.39）是钙调蛋白（calmodulin）依赖性或含钙调蛋白的细胞色素p450类血红素蛋白（hemoprotein），分子量为130至160KD的二体蛋白，其催化结构域包括还原酶、加氧酶、黄素腺嘌呤二核苷酸（Flavin adenine dinucleotide；FAD）、核黄素单苷酸（flavin mononucleotide；FMN）等要素，在辅助因子四氢生物喋呤（tetrahydro-biopterin）的帮助下，进行非芳香类氨基酸L-精氨酸（L-arginine）的5’端电子氧化。一氧化氮合成酶催化L-精氨酸末端的氮原子，在还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）和氧气的参与下，成为一氧化氮（nitric oxide）的合成反应。一氧化氮合成酶有三种异构体：神经元型（neuronal NOS；nNOS；NOS1）、内皮细胞型（endothelial NOS；eNOS；NOS3）和巨噬细胞型（macrophage NOS；mNOS；NOS2），前二者为结构型一氧化氮合成酶（constitutive NOS；cNOS），后者为诱导型一氧化氮合成酶（inducible NOS；iNOS）。iNOS属于无钙性，是在细胞因子如白介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素-γ(IFN－γ)、内毒素等诱导下由血管平滑肌细胞、巨噬细胞、心肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞及上皮细胞产生的。其作用产生的NO远多于由cNOS作用产生的NO为多。诱导型一氧化氮合成酶与免疫反应、抵抗病源微生物等机制有关，尤其在败血症休克、自主免疫性疾病等发挥作用。基于底物L-精氨酸，在诱导型一氧化氮合成酶特异性抑制剂氨基胍（aminoquanidine）存在与否的情况下，以及NADPH和氧气的参与下，由诱导型一氧化氮合成酶催化产生一氧化氮气体和瓜氨酸（citrulline）；在液体中，一氧化氮迅速转变成稳定且不挥发的硝酸和亚硝酸，进而使用硝酸还原酶（nitrate reductase；NaR），催化硝酸还原为亚硝酸的反应，然后通过格里斯试剂（Griess Reagent）氨苯磺胺（sulfanilamide）和N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐（N-(1-Naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride；NED），在酸性条件下的重氮化（diazotization）反应，产生紫红或粉红色的偶氮化合物（Azo compound），通过其吸收峰值的变化（540nm波长），同时使用乳酸脱氢酶系统去除多余NADPH对于格里斯反应的干扰，由此来定量分析诱导型一氧化氮合成酶的活性。其反应方式为：
产品内容
YIJI清理液（Reagent A） 毫升
YIJI裂解液（Reagent B） 毫升
YIJI缓冲液（Reagent C） 毫升
YIJI反应液（Reagent D） 毫升
YIJI酶解液（Reagent E） 毫升
YIJI底物液（Reagent F） 毫升
YIJI显色液（Reagent G） 毫升
YIJI标准液（Reagent H） 微升
YIJI专性液（Reagent I） 微升
产品说明书 1份
保存方式
保存YIJI反应液（Reagent D）、YIJI酶解液（Reagent E）和YIJI专性液（Reagent I）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；YIJI反应液（Reagent D）和YIJI显色液（Reagent G）避免光照；有效保证6月
用户自备
YIJI完全缓冲液（Reagent J）：用于检测纯化诱导型一氧化氮合成酶或体外检测
15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器
1.5毫升离心管：用于制备样品和标准品的容器
（微型）台式离心机：用于样品处理
细胞刮脱棒：用于脱离贴壁细胞
恒温水槽：用于反应孵育
96孔板或比色皿：用于比色的容器
酶标仪或分光光度仪：用于样品比色分析
实验步骤
实验开始前，设定好分光光度仪或酶标仪（温度为25℃）：波长540nm，并置零。然后进行下列操作。
一、样品准备
准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 106细胞）
小心抽去培养液
小心加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），覆盖生长表面
小心抽去清理液
使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）
加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），混匀细胞
移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
小心抽去上清液
加入xx毫升YIJI裂解液（Reagent B）
涡旋震荡5秒，充分混匀
即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器
在冰槽里用研磨棒匀化（约80下）
将所有匀浆物移入2毫升离心管
放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
小心移取1毫升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒）
即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、标准样品配制
准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管
分别加入xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到2至5号管
移取xx微升YIJI标准液（Reagent H）到1号管
小心移取xx微升1号管的YIJI标准液（Reagent H）到2号管，混匀
小心移取xx微升2号管稀释的YIJI标准液（Reagent H）到3号管，混匀
小心移取xx微升3号管稀释的YIJI标准液（Reagent H）到4号管，混匀
将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表
管号 | GENMED缓冲液（Reagent C） | GENMED标准液（Reagent H） | 标准一氧化氮浓度 |
1 | － | xx微升 | xx微摩尔/升 |
2 | xx微升 | xx微升1号管 | xx微摩尔/升 |
3 | xx微升 | xx微升2号管 | xx微摩尔/升 |
4 | xx微升 | xx微升3号管 | xx微摩尔/升 |
5 | xx微升 | 0 | 0 |
标准曲线测定
移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
加入xx微升上述配制的YIJI标准液（Reagent H）
加入xx微升YIJI反应液（Reagent D）
枪头抽吸数次，混匀
室温下孵育60分钟
加入xx微升YIJI酶解液（Reagent E）
室温下孵育20分钟
加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
加入xx微升YIJI显色液（Reagent G）
室温下，孵育10分钟，避免光照
即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数
重复实验步骤1至11四次
构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光读数；横座标（X轴）为标准一氧化氮浓度（微摩尔/升）
样品总活性测定
移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
加入40微升上述准备的待测样品（注意：细胞裂解样品为50微克蛋白）
加入xx微升YIJI反应液（Reagent D）
枪头抽吸数次，混匀
室温下孵育60分钟
加入xx微升YIJI酶解液（Reagent E）
室温下孵育20分钟
加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
加入xx微升YIJI显色液（Reagent G）
室温下孵育10分钟，避免光照
即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数
根据标准曲线获得样品总活性对应一氧化氮浓度（微摩尔/升）
计算样品酶总活性
样品非特异活性测定
移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
加入xx微升YIJI专性液（Reagent I）
加入40微升上述准备的待测样品（注意：细胞裂解样品为50微克蛋白）
加入xx微升YIJI反应液（Reagent D）
枪头抽吸数次，混匀
室温下孵育60分钟
加入xx微升YIJI酶解液（Reagent E）
室温下孵育20分钟
加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
加入xx微升YIJI显色液（Reagent G）
室温下孵育10分钟，避免光照
即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数
根据标准曲线获得样品非特异活性对应一氧化氮浓度（微摩尔/升）
计算样品酶非特异活性
计算样品活性
酶标仪测定
样品总活性测定
在96孔板上做好相应标记：标准样品和待测样品
分别移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到所有孔里
分别加入xx微升上述配制的YIJI标准液（Reagent H）或待测样品（注意：细胞裂解样品为50微克蛋白）到相应孔里
分别加入xx微升YIJI反应液（Reagent D）到所有孔里
轻轻摇动96孔板
室温下孵育60分钟
加入xx微升YIJI酶解液（Reagent E）
室温下孵育20分钟
加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）到所有孔里
加入xx微升YIJI显色液（Reagent G）到所有孔里
轻轻摇动96孔板
室温下孵育10分钟
即刻放进酶标仪检测：获得吸光读数
构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光读数；横座标（X轴）为标准一氧化氮浓度（微摩尔/升）
根据标准曲线获得样品总活性对应一氧化氮浓度（微摩尔/升）
计算样品酶总活性
2）样品非特异活性测定
在96孔板上做好相应标记：待测样品
移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到相应孔里
加入xx微升YIJI专性液（Reagent I）
加入40微升待测样品（注意：细胞裂解样品为50微克蛋白）
加入xx微升YIJI反应液（Reagent D）
轻轻摇动96孔板
室温下孵育60分钟
加入xx微升YIJI酶解液（Reagent E）
室温下孵育20分钟
加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
加入xx微升YIJI显色液（Reagent G）
轻轻摇动96孔板
室温下孵育10分钟
即刻放进酶标仪检测：获得吸光读数
根据标准曲线获得样品非特异活性对应一氧化氮浓度（微摩尔/升）
计算样品酶非特异活性
3）样品特异活性计算
注意事项
本产品为25次操作，包括标准样品
操作时，须戴手套
本产品不适宜于纯化或粗提诱导型一氧化氮合成酶样品的检测；如果需要检测，建议另购使用YIJI完全缓冲液（Reagent J）
样品中避免含有各种还原性化学物质，包括巯基乙醇（2－mercaptoethanol）、二硫苏糖醇（dithiothreitol；DTT）、维生素C（ascorbic acid）和叠氮化钠（azide）等
如果用户没有540nm波长的滤波器，可以使用530至560nm之间的任一波长替代
避免使用胰酶脱离贴壁细胞
比色测定后，比色皿须清洗彻底
建议待测样本蛋白浓度为50微克/40微升（本公司提供 YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒）
如果待测样品浓度过高或过低，可以增加或减少甚至稀释样品量
诱导型一氧化氮合成酶单位活性定义为：在25℃，pH 7.5条件下，每分钟内能够生成1微摩尔一氧化氮所需的氨基胍敏感性酶量作为一个活性单位
本公司提供系列一氧化氮合成酶分析试剂产品
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