通用型HRP-AEC底物显色试剂盒使用说明

主要用途

通用型HRP-AEC底物显色试剂是一种旨在通过过氧化物酶的催化，底物3-氨基-9-乙基咔唑氧化形成红色不溶性产物，以此鉴定过氧化物酶活性，进而确定目标分子表达的权威而经典的技术方法。其适用于辣根过氧化酶标记蛋白的免疫学检测包括蛋白质西方杂交和免疫化学，以及原位杂交染色等。产品即到即用，性能稳定，操作便捷，敏感度高，显色清晰，重复性好。

技术背景

3-氨基-9-乙基咔唑（3-amino-9-ethylcarbazole；AEC）是过氧化物酶（Peroxidase）的生色底物，其分子式为C14H14N2，分子量为210.3。在过氧化物酶的催化下，电子供体AEC底物在过氧化氢氧化下，失去电子而呈现出颜色变化和沉积，形成稳定性红色不溶性产物，但溶解于有机溶剂中。被用于检测过氧化物酶的活性，灵敏度高，特异性好。

产品内容

染色液（Reagent A）  5毫升

稀释液（Reagent B） 90毫升

反应液（Reagent C）     5毫升

产品说明书      1份

保存方式

保存在4℃冰箱里；染色液（Reagent A），避免光照；有效保证6月

用户自备

无离子水：用于清洗样品

PBS缓冲溶液：用于清洗样品

苏木素复染试剂盒（80067.2）：用于常规染色后复染

15毫升锥形离心管：用于染色工作液配制的容器

平式摇荡仪：用于孵育和混匀反应

2.2毫升离心管：用于染色工作液配制的容器

光学显微镜：用于染色后观察分析

实验步骤

• 免疫印迹染色

实验开始前，移取500微升染色液（Reagent A）到15毫升锥形离心管，加入9毫升稀释液（Reagent B），混匀后，加入500微升反应液（Reagent C），混匀后，标记为染色工作液，避免光照。然后进行下列操作。

• 准备好含有待测蛋白的固相膜（5 X 8 cm²）：包括电泳、转印、封阻、一抗（或生物素）处理、辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗（或链霉亲和素）处理、清洗等步骤

• 加入5毫升室温预热的染色工作液，铺满整个固相膜表面

• 置于平式摇荡仪上，在室温下孵育5至10分钟，或直至红色沉淀出现；避免光照

• 用镊子夹起固相膜，放进无离子水里清洗

• 空气中晾干

• 数码相机拍照记录
  

免疫化学染色

实验开始前，移取100微升染色液（Reagent A）到2.2毫升离心管，加入1.8毫升稀释液（Reagent B），混匀后，加入100微升反应液（Reagent C），充分混匀，标记为染色工作液，置于暗室。然后进行下列操作：

• 准备好含有待测蛋白的组织切片：包括固着、封阻、一抗（或生物素）处理、辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗（或链霉亲和素）处理、清洗等步骤

• 室温下，小心加上100微升的染色工作液，铺满整个切片样品表面

• 室温下孵育5至30分钟，或直至样本出现红色

• 小心移去切片上的染色工作液

• 室温下，小心将切片置入50毫升用户自备的PBS缓冲溶液中浸泡5秒

• 小心移去切片上的PBS缓冲溶液

• （选择步骤）进行苏木素复染（注意：建议使用苏木素复染试剂盒－80050）

• 放上盖玻片或封片

• 即刻在一般光学显微镜下观察：阳性呈现红色
  

注意事项

• 本产品为10次（10毫升/次）或1000次（100微升/次）操作

• 可用于1000 cm²免疫印迹膜片：建议5毫升用于1张5 X 8 cm²膜片 

• 可用于1000片1 cm X 1 cm大小的组织切片

• 用户可以根据需求，调整试剂用量

• 操作时，须戴手套

• 染色时间根据情况调整，不宜过长，以免造成过度显色

• 如果封闭欠佳，易造成背景颜色过深

• 染色工作液新鲜配制，不宜超过1小时；如果发现沉淀，不宜使用

• 固相膜染色后数小时将会褪色，不能永久存在

• 本产品只能用于辣根过氧化酶（HRP）标记的杂交和沉淀反应

• 染色后可用苏木素复染，增强对比度；建议使用 MAYER’S苏木素复染试剂盒－80067.2

• 染色后不能使用乙醇等有机溶剂清洗

• 本公司提供系列组化染色试剂
  

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定

• 本产品经鉴定显色清晰