材料
1X 无菌 PBS
Anti-human CD3:
Clone OKT3 (Functional Grade, eBioscience Cat. No. 16-0037) or Clone HIT3a (Functional Grade, eBioscience Cat. No. 16-0039)
RPMI-1640 完全培养基
无菌 PBMC
96孔平底带盖微孔板
MTT Buffer
MTT 裂解液
仪器用具
微量移液器或排枪
离心机
37°C, CO2 培养箱
96 孔板读板机
实验时间
30 分钟制备 PBMCs
20 分钟设置分析
2-4 天孵育
实验步骤
1、 制备PBMCs并重悬于RPMI完全培养基中,浓度 1-2x106/ml。可根据实验调整细胞浓度至 2-3x106/ml~105/ml。
2、 每孔加 100μl 细胞悬液,每种样品做复孔。
3、 每孔加 100μl 可溶性抗体,优化抗体浓度。若使用分离的 T 细胞做增殖分析,推荐用 10μg/ml 抗体包被在 96 孔板上进行刺激。
4、 放置于潮湿的 37°C, 5% CO2 培养箱中。
5、 孵育 2-4 天。可根据具体的实验进行优化。
6、 每孔加 20μl MTT buffer 再放回至培养箱中孵育 4 小时。
7、 每孔加 50μl MTT 裂解液,轻轻振荡并孵育过夜。
8、 第二天 570nm 读板。
9、 计算平均值和标准方差,作图。
缓冲液和培养基
RPMI-1640 完全培养基:
900ml RPMI-1640
热灭活的 100ml FBS(10%终浓度)
1ml 2-巯基乙醇
10ml L-谷氨酸盐
抗生素混合物(可选)
MTT Buffer:
MTT 贮存液:溶于 1X PBS,浓度为 5mg/ml,避光保存
MTT 裂解液:
20% SDS 50% DMF
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anti-mouse CD3 (epsilon subunit; CD3e)
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