实验运行
第一步：加载384孔黑色FLIPRTETRA系统枪头
第二步：在ScreenWorks®软件中创建一个FLIPRTETRA系统实验方案。 相机和记录参数设置见表1。移液和加样参数见表2和3。在本次实验中未使用悬浮细胞装置。移液加样过程中的维持和排空体积设置可能会产生气泡，引起信号误差。更新软件设置之前保存文件。
第三步：确保腔肠素加入至细胞板并避光。选择下列合适的方法来完成您的实验。
这里列出了三种不同过程的实验方案：
只有激动剂的实验
第四步： 加入25 μL 2X 激动剂至细胞板中，然后记录数据30-60秒。
或者
激动剂和抑制剂的实验
第四步： 加入25 μL 2X 抑制剂至细胞板并记录数据。
第五步： 避光孵育细胞板15-30分钟。
第六步： 加入25 μL 3X 激动剂至细胞板并记录数据
或者
实验前抑制剂的添加
第四步： 实验前先加入抑制剂至细胞板并孵育是可接受的。
第五步： 避光孵育细胞板15-30分钟。
第六步：加入25 µL 3X 激动剂至细胞板并记录数据。
数据简化
图1所示的RLU 信号的数据简化是在ScreenWorks软件中根据信号的反应/背景进行计算的。图2所示的RLU 信号简化是在ScreenWorks软件中根据信号的最大值—最小值进行计算的。量效曲线是采用GraphPad Prism® 3软件进行计算的。
结果
检测范围评估
在本次实验中，采用细胞数梯度减少来决定实验的检测范围。细胞在37°C和5%CO2条件下过夜培养使其在实验前充分贴壁。配有化学发光检测部件的FLIPRTETRA 系统在记录时添加激动剂至贴壁细胞。RLU值既可以用于最大值减去最小值的计算也可以用于效应相对于背景信号的计算。根据实验中每孔1250个细胞计算的EC50值与每孔10000个细胞的结果是类似的。图1显示了随着细胞数量增加信号窗口的增加。在每孔2500个细胞时，信号窗口大约是300:1，与之相比较FLIPR®
Calcium 4 Assay
Kit荧光信号窗口大约是4：1（数据未列出）。之后的贴壁细胞实验采用每孔2500个细胞来完成，过夜种板培养。贴壁细胞Photina
实验可以在中低细胞密度下完成，并且在EC80 筛选浓度下得到很好的Z值。图1所示信号效应是按照反应/背景来计算的。
激动剂和抑制剂的反应
在图2 所示的实验中，在优化好的细胞浓度条件下比较了激动剂效应和抑制剂效应。384 孔黑壁底透的细胞板每孔中种下2500 个CHO mito-Photina/H3 细胞并在37°C 和5% CO2 下过夜培养。培养基去除后，在实验缓冲液中加入5 μM 天然腔肠素并避光孵育四小时。
在本实验中，数据简化结果是按照记录阶段最大值减去最小值来计算的。激动剂的EC50 和抑制剂IC50 值与文献报道的数值是一致的。
配有化学发光检测部件的FLIPRTETRA 系统表现出更卓越的信号检测能力。不仅表现在一个相机可以检测荧光和化学发光，而且相机的增益可调节，从而在化学发光检测时可达到无与伦比的动态范围。在进行化学发光高通量筛选实验中系统是被证明很有用途的。在配有化学发光检测部件的FLIPRTETRA 系统中基于发光蛋白的钙流实验具有以下优点：
Ø 系统无与伦比的动态范围可以检测从极亮至昏暗的所有光信号。
Ø 更低的背景噪音，更高的信噪比和更大信号窗口
Ø 更低的细胞数量，减少细胞培养工作量
Ø 实验更灵活，贴壁细胞或悬浮细胞均可进行实验
Ø 可超过6 小时的长时间持续实验
Ø 无论是激活还是抑制实验均可以得到与文献报道高度一致性的数据结果
Ø 消除了化合物自发荧光对结果的干扰
Ø 更低的试剂耗费
参考文献
S. Bovolenta, M. Foti, Lohmer, S., S. Corazza. Development of a Ca2+-Activated Photoprotein, Photina, and Its Application to High-Throughput Screening. J Biomol Screen 2007; Vol. 12(5) 694–704.
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