一、细胞和试剂的准备 1. 细胞样品:来源淋巴细胞或外周血的白细胞。
2. 荧光标记单克隆抗体:常用的有FITC(fluorescein -isothiocyanate)和PE(phycoerythrin)标记的单克隆抗体。
3. 封闭抗体:抗Fc受体抗体
4. FACS缓冲液: 1×PBS 950 ml FCS 40 ml 10%叠氮钠溶液 10 ml 5. 仪器缓冲液(FACS-flow):仪器厂家提供
6. FACS清洁液(FACS clean )和FACS洗净液(FACS rinse):仪器厂家提供。
二、操作步骤
1. 单细胞悬液的制备:将1×105~1×107的细胞放入1.5 m l离心管中3000 r/min 离心5分钟,弃上清;加入FACS缓冲液100 μl 悬浮细胞。 2. 封闭细胞表面Fc受体:在步骤1中加入Fc受体抗体0.5 μl(0.5 mg/ml),水浴3分钟。
3. 细胞与荧光抗体结合:在步骤2中加入荧光抗体1 μl(0.5 mg/ml),水浴30分钟。
4. 洗细胞去除游离的荧光抗体:在步骤3中加入FACS缓冲液350 μl,轻轻混匀,3000 r/min,离心5分钟,弃上清,重复步骤(4)2次。
5. 上样前处理:取100 μl 仪器缓冲液加入步骤(4)获得的细胞沉淀中,轻轻混匀悬浮细胞,将细胞悬液移入FACS专用管中,准备进行仪器检测和分析。
三、仪器的操作
以FACSCaliburTM(BD Biosciences)仪器为例。仪器主要分为主机部分(包括激光激活源,射流,射线探测器)和计算机部分(CELLQuest softwere)。仪器的操作分为使用前的准备、使用中的操作和使用后的清洗。
1.使用前的准备
(1)打开电源:包括系统电源和主机部分电源。
(2)检查供液槽和废液槽:供液槽应含足够的仪器缓冲液,废液槽应在上次使用后清洗干净。
(3)使机器处于负亚状态,才能使细胞悬液被吸入至机器的吸管口。
(4)机器处于可应用状态时,指示灯会变成绿色。
2.使用中的操作
(1)计算机部分—使用CELLQuest程序系统软件:
①设定所要检测细胞的数量:一般设10 000~20 000个细胞。
②命名本次实验:一般含使用者的姓名和实验日期。
③打开记数部分:显示进入的细胞数以及检测一定量的细胞所需要的时间。
④将微机与主机连接:控制检测时的预检测和实际检测。
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