材料和方法
样品
此报道中用到的野生型RET基因的DNA基因组样品或有RET序列变化的样品在以前描述过。RET基因序列变化改变RET蛋白的功能引发MEN2综合症的是突变，然而RET序列改变不会引发MEN2综合症是多态。不能确定意义的稀有的或不会引起MEN2综合症的RET基因序列变化成为“序列变化”。在这份报告中，通过密码子数列出RET序列变化，野生型编码DNA序列后面是编码序列改变，伴随着加粗突变核苷酸（例：618（TGC→TAC）），反之多态及序列变化用下划线标出。所有测试的RET序列变化的样品均有单个核苷酸改变，并且是杂合的除非有另外的阐明。RET突变基因型和多态性及序列变化基因型列于表1。
*序列变化是杂合的除非在文本上另作说明。密码子DNA序列列出核苷酸改变，加粗突变且多态性或序列变化使加下划线的。•，可用的RET序列变化样品。
†未知意义的稀有序列变化或不引发MEN2综合症；查看参考文献。在RET致病密码子范围内密码子609或611的3个突变体与MEN2综合症没有联系。密码子922和852的突变体以前在MTC病人上发现过，也许不会引发MEN2综合症。
‡良性多态性，0.26等位基因频率。
§806与804突变在同一等位基因时致病。
引物和探针
用完整DNA技术合成寡核苷酸。用Primer3设计引物。选择引物和探针检测所有已知RET突变，不包括分析中的普通多态（表2）。非标记探针包含有3’磷酸化或3’氨基修饰（整合DNA技术），避免PCR反应中的延伸。设计的探针用于分析每个外显子的突变热点。
RET基因分型实验中用了4种非标记探针（表2）：野生型（WT）探针，特定突变（MS）探针，只遮蔽单一多态核苷酸的遮蔽探针，遮蔽3个多态核苷酸的位置探针（一个密码子）。比如说，外显子13遮蔽探针（遮蔽1bp
769）在多态核苷酸位置有单个碱基的缺失。（WT13探针的“T”位置，表2）。外显子10和11位置探针与野生探针序列相比有3个核苷酸缺失，遮蔽一个致病密码子分辨密码子突变的位置。外显子10和11在致病密码子位置有同样的序列改变。比如说：外显子10，MS618/620TAC探针在密码子618-620有TAC序列，
如表2描述。
*最终引物的浓度和上下引的比例在引物序列上显示。列出引物序列从5’到3’，上游引物在下游引物上部。
†每个探针集下是密码子的变化。下划线密码子包括了多态或序列变化，反之其它密码子包括突变。
‡遮蔽，遮蔽1-3个核苷酸的缺失。主要实验中的野生型探针序列用于每个外显子，除了外显子16。如果两个野生型探针用于一个外显子，标记做A和B探针。
§探针序列从5’到3’显示，RET外显子10、13、14和16是上游探针，反之，外显子11是下游探针。已知突变的位点加粗，可能的多态性或序列变化位点用下划线表示。
¶位置（L）探针与野生型探针序列致病密码子相比有3个核苷酸遮蔽缺失（---）。
‖用于外显子10,11突变的基因分型的MS探针的例子。在探针内致病密码子位置的相同的特定突变序列。这些探针有特定突变序列的名称，改变的序列加粗。有7个可能的从TGC
野生型半胱氨酸到其他氨基酸的突变序列改变。因此，21个MS探针中的7个特定突变探针（AGC，CGC，GGC，TAC，TCC，TTC，TGG）是用于外显子10和11突变。用于每个突变基因分型的MS探针用图解法表示，表3和补充表格1-5。
**外显子13的主要和第二次试验用遮蔽探针。遮蔽 1bp 769 主要探针及外显子特定突变探针在密码子769多态位置有单核苷酸缺失（缺失野生型探针序列有下划线的“T”）。
††外显子16用918（ATG-ACG）密码子特定突变探针做主要实验。
PCR
用之前描述的不对称快速PCR扩增样品DNA，除了用表2中给出的引物浓度反应55个循环。外显子14反应包括2个探针，0.5μmol/L的WT14A探针和0.25μmol/L的WT14B探针。在主要实验和第二次实验一个野生型对照与每个探针一起参加反应。外显子13， WT13主要的实验反应用2个额外的对照：杂合和纯合密码子769样品。外显子10主要实验反应用620（TGC→AGC）突变样品作为正对照。
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