(仅供参考)
冻干菌种 | 号:58003(CS) 参阅附录1 |
无细菌百日咳菌悬液 | 含有20% 健康羊血的B-G 斜面,2支 |
36℃培养 72hr | |
传代培养 | 活性炭斜面,6个克氏瓶 |
36℃培养 48hr | |
摇床培养 | 培养基:参阅附录3 装有4000ml 灭菌培养基的10L瓶子,6个 1. 比浊 2.镜检 3.纯菌 |
表面通气36℃培养20-24hr 120-160 rpm | |
发酵培养 (300L) | 培养基:同摇床培养 1. 血凝 2.镜检 3.纯菌 4.比浊 5.pH |
表面通气、搅拌,36℃培养30-36hr,340rpm | |
收获和杀菌 | 上清培养液血凝滴度>1:16,pH≤8.2 于培养液中加硫汞杀菌(1%→0.01%) |
盐析 | 发酵液中加入(NH4)2SO4 ,浓度为30.2%(w/v) |
2~8℃静置,7天 | |
离心收集沉淀 | |
4000rpm,4~8℃,6×1L,CR-7,4000rpm,30分 离心30min | |
浸提 | 用0.05M PB 1M NaCl,0.01%硫柳汞缓冲液(参阅附录4)浸提抗原 |
2~8℃,4~6天,每天振摇2次,1hr/次 | |
离心收集上清液 | R9A,4×1L,8000rpm,40分 |
8000rpm,4~8℃离心40min | |
盐析 | 上清液中加入(NH4)SO4,浓度为20.2%(g/ml) |
2~8℃静置7天 | |
离心收集沉淀 | |
11000rpm,4~8℃离心400min R10A3 10000rpm 50分 6×500ml R12A6 12000rpm 35分 4×500ml | |
复溶 | |
搅拌3小时 | |
透析 | 透析液:0.05M PB 1M NaCl 0.01% 硫柳汞收集上清液 纳氏试剂比色法:检测残余NH4+ |
2~8℃ | |
离心 | 收集上清液 |
4~8℃ 离心5hr 16000rpm ;R13A,12800rpm,5小时30分 或R19A,19000rpm,3小时28分; | |
蔗糖密度梯度离心 | 蔗糖浓度(参阅附录5):10%和30%,收集蔗糖浓度为5%~12%之间的抗原 |
RPZ35T转头,25,000~30,000rpm,4~8℃ 离心18~20hr | |
抗原 | 用Lowrry法测定蛋白氮含量:≥50μgPH/ml |
2~8℃保存 | |
稀释至最终蛋白 | 稀释液:0.05M PB 1M NaCl 0.01% 硫柳汞 |
解毒 | A:于抗原中加入戊二醛(2.5%→0.05%)溶液,20℃作用4hr B:然后用赖氨酸(参阅附录6)(10%→0.2%)终止反应,20℃作用2hr |
透析 | 用0.85% NaCl 0.01%硫柳汞(参阅附录7),透析直至戊二醛含量<0.001%(比色法) |
超声匀化 | 2~8℃,透析7~14天 |
2~8℃保存 | |
原液 | 1. 蛋白氮含量测定 2. 镜检 3. 无菌试验 4. 不耐热毒素试验 5. 特异性毒性试验 5.1 小鼠体重减轻试验:≤10BWDU/ml 5.2 小鼠白细胞毒性增加试验:≤0.5LPU/ml 5.3 小鼠组胺致敏毒性试验:≤0.8HUS/ml 6. 毒性逆转试验:≤0.8HUS/ml 7. 保护性试验 8. 热源试验 |
2~8℃保存 | |
DTaP配方 | aP:18μgPH/ml D:25Lf/ml T:7Lf/ml Al(OH)3:1.3mg/ml(参阅附录8) |
成品 | 1. 鉴别试验 2.终容器检查 3. 化学试验 4. 无菌试验 5. 特异性毒性试验 6. 保护性试验 7. 毒性逆转试验 |