PCR Array 简单实用的检测基因表达的高通量方法（三）

PCR 芯片实验体系    完整的PCR芯片实验体系包括RT²Profiler^TM PCR芯片，RT² Real-Time^TM  SYBR Green PCR反应体系和cDNA合成试剂盒。所有这些组分均为基于SYBR  Green的实时定量PCR反应优化。精心设计的引物和优化的PCR反应体系一起，为PCR芯片的特异性提供保证。在反应体系中还加入了指示染料，用于检测PCR反应平台的可靠性。
RT² PCR引物和RT² Real-Time^TM SYBR Green PCR反应体系 采用PCR芯片开展研究，技术上的难点是如何在同一次实验中，相同的PCR反应条件下保证不同的基因有相近的扩增效率，并且获得与单个基因实时定量PCR反应相当的灵敏度，特异性和可重复性。为此，SuperArray首先设计筛选出最佳的候选引物，接着通过实验，在不同反应条件下，检测PCR反应体系与几千条PCR引物的组合，最终获得了优化的引物和PCR反应体系，适应PCR芯片的要求。 
RT²Profiler^TM PCR芯片引物的特点 通过计算机分析和实验验证，引物达到以下要求： 1.特异性：通过BLAST等比对方法，检测确认引物在相应物种（人，小鼠或大鼠）全基因组中的高度特异性，有效避免非特异性产物产生。并通过实验证明引物不会扩增E.coli基因组，后者是Taq DNA多聚酶的常见污染源。 2.均一性：所使用的引物的CG含量，解链温度（Tm），以及其他一些化学的和物理的特性都相似，以保证在相同的PCR条件（尤其是相同退火温度）下，芯片中的不同的基因都能扩增出特异性产物。 3.扩增效率：引物扩增的片段大小均在100到200bp左右，确保在相同的反应时间内，不同的基因均能扩增出完整片段；并增强引物3’ 端的铆定能力，减少引物二聚体和非特异性退火的发生。
RT²Profiler^TM PCR芯片PCR反应体系的特点 在基于SYBR Green的实时定量PCR反应中，PCR反应体系也起到重要作用。严格控制的热启动Taq酶是一个关键因素。RT² Real-Time^TM PCR反应体系采用了一种独特的，经过化学修饰的热启动Taq酶，只有在热激步骤之后，酶的活性才能完全发挥。在严格控制反应条件的情况下，在较低温度下发生的非特异性引物结合无法进一步扩增。其他的反应体系则常常将这些模板进一步扩增成为非特异性产物，造成假阳性结果。此外，Superarray还对RT² Real-Time^TM PCR反应体系中的化学组分进行优化，进一步减少了引物二聚体的形成，并能保证最难扩增的片段都得到极高的扩增效率。PCR芯片结合了高质量的PCR引物设计和RT² Real-Time^TM PCR反应体系，为PCR的高芯片质量提供了保证。 表格2总结了RT²Profiler^TM PCR芯片的特点。 　

表2  RT²Profiler^TM PCR芯片的特点