细胞培养试剂、冷冻和复苏（一）

细胞培养基

市场上可提供干粉培养基和液体培养基：

       干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。缺点是配制过程繁琐，质量不易控制；

       液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，而且使用十分方便

常用的培养基种类：

       RPMI-1640（标准型）、DMEM-高糖（标准型）、DMEM-低糖（标准型）、McCoys 5A、 M199、F10等

1000 ml RPMI 1640培养基

RPMI 1640 干粉培养基10.4g（1包）

蒸馏水 400ml

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磁力搅拌至完全溶解 

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加三蒸馏水定容至1000ml

       在超净台内无菌条件下，用灭菌后的并置有0.22μm孔径滤膜的过滤器除菌，并分装成200 ml/瓶，-20℃保存备用。

       用前取一瓶溶解，每200 ml培养液加灭活的小牛血清至终浓度为10%，即加22ml。再加青霉素和链霉素至终浓度各为100 U/ml。

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细胞培养液

血清

热灭活：56℃, 30 分钟加热已完全解冻的血清

热灭活目的：灭活血清中的补体成分。如果不做细胞因子和免疫相关的实验，建议血清不要灭活。因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，还会影响血清的质量。灭活后严重影响细胞生长速度，且细胞贴壁率降低。

血清中的沉淀物：

— 絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000 rpm, 5 分钟去除，也可不用处理

— 显微镜下“小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”，常误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批号的血清

平衡盐液体

       组织细胞培养中常用的基本液体，可以维持渗透压、调节pH值、供给细胞生存所需的能量和无机离子成分，用于洗涤组织、细胞等

PBS（Phosphate-Buffered Sallines）：

    KCl                       0.20g             KH₂PO₄                 0.20g

      NaCl                     8.00g             Na₂HPO₄•7H₂O      2.16g

DPBS（Dulbecco’s Phosphate-Buffered Sallines）标准型

CaCl₂(无水氯化钙)       0.10g      KCl                     0.20g

KH₂PO₄                 0.20g             MgC_l2·6H2O        0.10g

NaCl                    8.00g             Na₂HPO₄·7H₂O      2.16g

D-Hanks’ 平衡盐溶液(D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS)

KCl                0.40g      KH₂PO₄          0.06g

NaCl              8.00g      NaCO3        0.35g

Na2HPO4       0.048g    D-Glucose      1.00g      Phenol Red     0.01g

消化液：分离组织和分散细胞

—    常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠(EDTA)两种溶液

—    单独或混合使用

胰蛋白酶溶液

—    主要作用：使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散

—    消化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，能终止消化作用

       —    胰蛋白酶溶液配制

              1、称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许D-Hanks 平衡盐溶液调成糊状，再补足D-Hanks 平衡盐溶液，搅拌混匀，置室温4 小时或冰箱过夜，不断搅拌振荡

              2、次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中， -20℃保存备用（以免分解失效），常用浓度为0.25% （0.1%-0.5%）

              3、胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氢钠溶液调pH 至7.2 左右