(五)聚焦层析法
聚焦层析是一种操作简单、廉价的层析技术。它的原理是根据各种蛋白质的等电点不同进行分离的过程,因此本方法具有高分辨、高度浓缩和高度专一等特点。聚焦层析所用的凝胶首先用高pH溶液平衡,然后用多元缓冲液进行洗脱,多元缓冲液pH呈梯度下降。
聚焦层析所用凝胶主要有两种:MONOP和多元缓冲液交换剂(PBE)。其中MONOP是带孔小珠,孔中被带正电荷的胺基填充,适用于高效聚焦层析。多元缓冲液交换剂是一种交换凝胶,适用作普通聚焦层析的介质。各种凝胶性质见表16-8。
凝胶名称 | pH范围 | 洗脱 |
MONOP | 11-8 | Pharmalyte 8-10.5 |
PBE | 11-8 | Pharmalyte 8-10.5 |
MONOP | 9-6 | 多元缓冲液96 |
PBE 94 | 7-4 | 多元缓冲液74 |
PBE94 | 7-4 | 多元缓冲液74 |
表16-8 聚焦层析技术数据 |
NONOP可制成两种高效液相柱:MONOP HR5/5(1ml),和MONOP HR5/20(5ml)。使用时根据样品复杂性选择相应的柱。HR5/5分辨率为pI>0.2,HR5/20 pI>0.02。
多元缓冲液交换剂PBE,属珠状交换剂凝胶,有PBE 118(pH11-8)和PBE(pH9-4)。在聚焦层析时,通过使用不同的洗脱液,可使交换容量发生改变,并且使pH达到更广的范围。