三、色谱柱
色谱是一种分离分析手段，分离是核心，因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各种微粒填料如多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球（包括离子交换树脂）、多孔碳等，其粒度一般为3,5,7,10μm等，柱效理论值可达5~16万/米。对于一般的分析只需5000塔板数的柱效；对于同系物分析，只要500即可；对于较难分离物质对则可采用高达2万的柱子，因此一般10~30cm左右的柱长就能满足复杂混合物分析的需要。
柱效受柱内外因素影响，为使色谱柱达到最佳效率，除柱外死体积要小外，还要有合理的柱结构（尽可能减少填充床以外的死体积）及装填技术。即使最好的装填技术，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情况总是不一样的，靠近管壁的部位比较疏松，易产生沟流，流速较快，影响冲洗剂的流形，使谱带加宽，这就是管壁效应。这种管壁区大约是从管壁向内算起30倍粒径的厚度。在一般的液相色谱系统中，柱外效应对柱效的影响远远大于管壁效应。
1．柱的构造
色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成。柱管多用不锈钢制成，压力不高于70 kg/cm2
时，也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。为提高柱效，减小管壁效应，不锈钢柱内壁多经过抛光。也有人在不锈钢柱内壁涂敷氟塑料以提高内壁的光洁度，其效果与抛光相同。还有使用熔融硅或玻璃衬里的，用于细管柱。色谱柱两端的柱接头内装有筛板，是烧结不锈钢或钛合金，孔径0.2~20μm(5~10μm)，取决于填料粒度，目的是防止填料漏出。
色谱柱按用途可分为分析型和制备型两类，尺寸规格也不同：①常规分析柱（常量柱），内径2~5mm（常用4.6mm，国内有4mm和5mm），柱长10~30cm；②窄径柱（narrow
bore，又称细管径柱、半微柱semi-microcolumn），内径1~2mm，柱长10~20cm；③毛细管柱（又称微柱microcolumn），内径0.2~0.5mm；④半制备柱，内径＞5mm；⑤实验室制备柱，内径20~40mm，柱长10~30cm；⑥生产制备柱内径可达几十厘米。柱内径一般是根据柱长、填料粒径和折合流速来确定，目的是为了避免管壁效应。
2．柱的发展方向
因强调分析速度而发展出短柱，柱长3~10cm，填料粒径2~3μm。为提高分析灵敏度，与质谱(MS)联接，而发展出窄径柱、毛细管柱和内径小于0.2mm的微径柱（microbore）。细管径柱的优点是：①节省流动相；②灵敏度增加；③样品量少；④能使用长柱达到高分离度；⑤容易控制柱温；⑥易于实现LC-MS联用。
但由于柱体积越来越小，柱外效应的影响就更加显著，需要更小池体积的检测器（甚至采用柱上检测），更小死体积的柱接头和连接部件。配套使用的设备应具备如下性能：输液泵能精密输出1~100μl/min的低流量，进样阀能准确、重复地进样微小体积的样品。且因上样量小，要求高灵敏度的检测器，电化学检测器和质谱仪在这方面具有突出优点。
3．柱的填充和性能评价
色谱柱的性能除了与固定相性能有关外，还与填充技术有关。在正常条件下，填料粒度＞20μm时，干法填充制备柱较为合适；颗粒＜20μm时，湿法填充较为理想。填充方法一般有4种：①高压匀浆法，多用于分析柱和小规模制备柱的填充；②径向加压法，WatersZL；③轴向加压法，主要用于装填大直径柱；④干法。柱填充的技术性很强，大多数实验室使用已填充好的商品柱。
必须指出，高效液相色谱柱的获得，装填技术是重要环节，但根本问题还在于填料本身性能的优劣，以及配套的色谱仪系统的的结构是否合理。
无论是自己装填的还是购买的色谱柱，使用前都要对其性能进行考察，使用期间或放置一段时间后也要重新检查。柱性能指标包括在一定实验条件下（样品、流动相、流速、温度）下的柱压、理论塔板高度和塔板数、对称因子、容量因子和选择性因子的重复性，或分离度。一般说来容量因子和选择性因子的重复性在±5%或±10%以内。进行柱效比较时，还要注意柱外效应是否有变化。
一份合格的色谱柱评价报告应给出柱的基本参数，如柱长、内径、填料的种类、粒度、色谱柱的柱效、不对称度和柱压降等。
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