实验方法原理 三种不同的核酸酶——S1 核酸酶、RNA
酶、外切核酸酶Ⅶ被用来进行 RNA 定量,确定内含子位置,以及用来鉴定在克隆的 DNA 模板上的 mRNA 的 5' 端和 3'
端的位置。当检测 RNA 被杂交到 DNA 模板上时,用核酸酶 S1 进行保护试验的分析;当检测 RNA 被杂交到来自 DNA 模板的 RNA
上时用 RNA 酶。
实验材料 T4 噬菌体多聚核苷酸激酶大肠杆菌 DNA 聚合酶的 Klenow 片段S1 核酸酶S1 核酸酶消化缓冲液限制性核酸内切酶载体 RNA标准 RNA单链 RNADNA 探针
试剂、试剂盒 过硫酸铵复性缓冲液乙醇凝胶洗脱缓冲液RNA 杂交缓冲液S1 核酸酶终止缓冲液苯酚氯仿RNA 加样缓冲液乙酸钠TE四甲基乙二胺三氯乙酸
仪器、耗材 变性聚丙烯酰胺凝胶水浴Whatman 3 MM 滤纸
实验步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
过硫酸铵(10%)
10X 复性缓冲液(100 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5),100 mmol/L MgCl2,0.5 mol/L NaCl,100 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT))
乙醇
凝胶洗脱缓冲液(0.5 mol/L 乙酸铵,1 mmol/L EDTA ( pH 8.0),0.1% (m/V) SDS)
RNA 杂交缓冲液
S1 核酸酶终止缓冲液(4 mol/L 乙酸铵,50 mmol/L EDTA(pH 8.0),50 ug/ml 载体 RNA)
苯酚:氯仿(1:1,V/V)
RNA 加样缓冲液
乙酸钠(3 mol/L,pH 5.2)
TE ( pH 7.6)
四甲基乙二胺(TEMED)
三氯乙酸(TCA)(1% 和 10%)
2. 酶和缓冲液
T4 噬菌体多聚核苷酸激酶
大肠杆菌 DNA 聚合酶的 Klenow 片段(10 单位/μl)
S1 核酸酶(与 S1 核酸酶消化缓冲液一起使用)
S1 核酸酶消化缓冲液(0.28 mol/L NaCl,0.05 mol/L 乙酸钠(pH 4.5),4.5 mmol/L ZnSO4·7H2O)
限制性核酸内切酶
3. 凝胶
含 8 mol/L 尿素的变性聚丙烯酰胺凝胶
4. 核酸和寡核苷酸
载体 RNA ( 酵母 tRNA)
含有四种 dNTP 的溶液(20 mmol/L)(用 25 mmol/L Tris-Cl ( pH 8.0) 溶解 dNTP,分装成小份储于 -20℃。)
标准 RNA
溶于蒸馏水中的合成寡核苷酸(10 pmol/μl )
模板 DNA ( 1 μg/μl),单链
单链 RNA
5. 探针
均匀标记且是单链的 DNA 探针
6. 放射性化合物
[γ-32P] ATP(10 mCi/ml,3000 Ci/mmol)
7. 专用装备
水浴,分别预设为 65℃,85℃,95℃,以得到适合的消化温度以及理想的杂交温度。
Whatman 3 MM 滤纸(或相当材料)
二、方法
随机标记的单链 DNA 探针的制备
1. 制备含 8 mol/L 尿素的聚丙烯酰胺微型凝胶(13 cm X 15 cm X 0.75 cm ) ( 例如 Bio-Rad Mini-Protean)
(1) 混匀下列试剂
7.2 g 尿素
1.5 ml 10X TBE
加入适当量的 40% 丙烯酰胺(丙烯酰胺:甲叉丙烯酰胺 19:1)制备含有所需浓度的聚丙烯酰胺凝胶。
(2) 加水到终体积 15 ml
(3) 室温下在磁力搅拌器上搅拌直至尿素溶解。再加入:
120 μl 10% 过硫酸铵
16 μl TEMED
快速混匀溶液并将胶倒入微型胶的模子。
2. 在胶凝结的过程中,混合下列试剂:
10 pmol ( 1 μl)未标记的寡核苷酸
10 μl [γ-32P] ATP(10 mCi/ml,3000 Ci/mmol)
2 μl 10X 多核苷酸激酶缓冲液
6 μl H2O
10 单位(1 μl)多核苷酸激酶
将反应混合物 37℃ 温育 45 min,再 95℃ 温育 3 min 灭活多核苷酸激酶。
3. 向激酶反应中加入:
2 μl(2 μg)单链 DNA 模板
4 μl 10X 复性缓冲液
14 μl H2O
将反应混合物 65℃ 温育 10 min,再冷却到室温。
4. 向第 3 步的反应混合物加入:
4 μl dNTP 混合物
1 μl (10 单位)大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ的 Klenow 片段
将反应混合物室温温育 15 min,再 65℃ 温育 3 min 灭活 DNA 聚合酶。
5. 调整反应混合物的离子组成和 pH 值以适应限制性酶。加入 20 单位限制性酶,于适当温度消化 2 h。
6. 向限制性核酸内切酶消化反应中加入:
2 μl 载体 RNA
5 μl 3 mol/L 醋酸钠(pH 5.2)
用标准的乙醇沉淀法回收 DNA 探针。
7. 用 20 μl 凝胶上样缓冲液溶解 DNA,95℃ 温育 5 min 使之变性,然后快速冷却到 0℃。
用凝胶电泳纯化探针
8. 当 DNA 在 95℃ 温育时,清洗凝胶的加样孔除去尿素,立刻加入探针。
9. 电泳直至溴酚蓝到达凝胶的底部(200 mA 约 30 min)。
10. 除去灌胶装置,让胶贴附在底层玻璃板上。用塑料膜(例如 Saran 膜)包裹凝胶和玻璃板。确保胶和塑料膜间没有气泡。
注意:撬开玻璃片时,戴上保护眼睛的装置。
11. 让凝胶在 X 线片上曝光。在胶片上作出玻板角和边的永久的记号。同时作出溴酚蓝和二甲苯腈蓝位置的记号。
通常 2~10 min 的曝光足够得到放射标记探针的图像。
12. 分开玻璃板和胶片,用手术刀除去放射标记的条带。将切过的胶在一张新的胶片上曝光,以保证含有正确分子大小条带的凝胶区域确实被切下来。
13. 将切下的凝胶片段转入灭菌的微离心管中,加入恰好足够体积的凝胶洗脱缓冲液盖住凝胶(250~500 μl)。将盖上的离心管在摇床上室温过夜。
14. 最大转速离心 5 min。
15. 用自动的吸量装置将上清转入新的离心管中,注意不要吸入聚丙烯酰胺。标记的探针用液闪分光镜检测应为大约 10000 cpm/μl。
16. -70℃ 保存探针。
待测 RNA 和放射标记的 DNA 探针间的杂交
17. 将 0.5~150 μg 的 RNA ( 待测的和标准的)平均分入每一个灭菌的微型离心管中。向每一个管中加入过量的均匀标记的单链 DNA 探针。
18. 加入 10% 体积的 3 mol/L 醋酸钠(pH 5.2),2.5 倍体积的冰冷的乙醇,沉淀 RNA 和 DNA。0℃ 放置
30 min,最大转速 4℃ 离心 15 min 回收核酸。去除乙醇的上清,用 70% 的乙醇洗涤,再次离心。小心的除去所有的乙醇,将含有
RNA 和 DNA 的沉淀室温放置直至乙醇的残迹蒸发。
19. 用 30 μl 杂交缓冲液溶解核酸沉淀。吹吸几次以保证沉淀彻底溶解。
20. 将离心管的盖盖紧,将杂交反应在 85℃ 水浴温育 10 min 使核酸变性。
21. 快速将离心管转移到调至杂交温度(通常 65℃)的水浴中。转移过程中,不要让离心管冷却到低于杂交的温度。在选定的温度下,将 DNA 和 RNA 杂交 12~16 h。
S1 核酸酶消化 DNA-RNA 杂合体
22. 注意保持离心管浸没在水中,打开管盖。快速加入 300 μl 冰冷的 S1 核酸酶消化缓冲液,并立即将离心管从水浴中拿出。温和振荡以混匀离心管中物质,再将离心管转移到调至 S1 核酸酶消化温度的水浴中。根据所需要的消化程度,温育 1~2 h。
23. 将反应体系冷至 0℃。加入 80 μl S1 核酸酶终止缓冲液并振荡混匀溶液。
24. 用苯酚:氯仿萃取反应体系一次。反应体系在微型离心管中以最大转速室温离心 2 min,将上淸转到另一个离心管中。加入两倍体积的乙醇,混匀,-20℃ 放置 1 h。
25. 以最大转速 4℃ 离心 15 min 回收核酸。小心的除去所有的上清,将打开的离心管在室温放置直到可见的乙醇残迹蒸发掉。
用凝胶电泳分析 S1 核酸酶产物
26. 用 4 μl TE 缓冲液(pH 7.6) 溶解核酸沉淀。加入 6 μl 上样缓冲液并混匀。
27. 95℃ 温育核酸 5 min,立即转移到冰上。稍微离心使样品聚集在离心管的底部。
28. 用聚丙烯酰胺 8 mol/L 尿素的凝胶电泳检验放射标记的 DNA。
29. 当示踪染料在胶上移动了适当的距离后,关掉电源拆卸电泳装置。轻轻的橇开大玻璃板的一角并将大玻璃板从胶上移开。为确定方向,切下胶的一角。
30. 将含有胶的玻璃板转移到含过量的 10% 三氯乙酸的托盘中。室温下轻微晃动托盘 10 min。
31. 将 10% 的三氯乙酸溶液倒掉,换过量的 1% 三氯乙酸。室温摇动 5 min。
32. 倒掉 1% 的三氯乙酸溶液,用去离子水轻微的漂洗一下已被固定的胶。将玻璃板和胶一起拿出托盘,放在平的地方。用纸巾除去多余的水。
33. 剪下每一边都比胶长 1 cm 的 Whatman 3 MM 滤纸(或相同材料)。将纸置于胶的上面再将玻璃板颠倒过来从而把胶转移到滤纸上。
34. 移去玻璃板,把胶放在凝胶干燥器中 60℃ 干燥 1~1.5 h。
35. 获得干胶的放射自显影图。用光密度测定法或磷光成像法扫描图像,或者切下含有片段的凝胶用液闪分光光度计计量。