实验方法原理 在本方案中,当外源 DNA 大于 200~300 个核苷酸时,用重组 M13 噬菌体克隆感染细菌后释放至周围培养基中的单链 DNA 进行凝胶电泳分析即可鉴定。
实验材料 重组 M13 噬菌体单链 DNAM13 噬菌体重组噬菌斑M13 噬菌体非重组载体噬菌斑大肠杆菌 F' 菌株
试剂、试剂盒 SDSSSC蔗糖凝胶加样缓冲液
仪器、耗材 琼脂糖凝胶水浴
实验步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
SDS ( 2%, m/V)
20 X SSC
蔗糖凝胶加样缓冲液
2. 凝胶
琼脂糖凝胶(0.7%)悬于 0.5 X TBE, 含 0.5 μg/ml 溴化乙锭
3. 核酸和寡核苷酸
重组 M13 噬菌体单链 DNA
4. 专用设备
水浴,调至 65℃
5. 载体和菌株
在上层琼脂糖中的 M13 噬菌体重组噬菌斑
在上层琼脂糖中,分离良好的 M13 噬菌体非重组载体噬菌斑
大肠杆菌 F' 菌株
二、方法
1. 取单个噬菌斑,按方案“M13 噬菌体液体培养”的方法,在适当 F' 宿主中生长,制备推定的重组噬菌体的原种。
2. 用带有无菌吸头的微量移液器从每个上清中各取 20 μl 至一新微量离心管,剩余上清 4℃ 保存,备用。
3. 在每个 20 μl 上清中各加入 1 μl 2% SDS, 轻拍管壁混合内容物,65℃ 温育 5 min。
4. 在各管中加入 5 μl 蔗糖加样缓冲液,再轻拍混合内容物,用 0.7% 琼脂糖凝胶电泳分析,在 5 V/cm 条件下电泳,用已鉴定的带有已知大小外源序列的 M13 重组体单链 DNA 作为阳性对照。
5. 溴酚蓝迁移至胶末端后,在紫外线下照相。
6. 比较推定重组体释放的单链 DNA 与那些作为对照的非重组噬菌体释放的 DNA 的电泳迁移率。
7. 如果需要,可将凝胶上的单链 DNA 转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜,并用适当的放射性标记探针杂交,以确证外源 DNA 的存在。凝胶先用 10 倍体积的 20 X SSC 浸泡 45 min, 然后直接将 DNA 转移至膜上。