用T4 RNA 连接酶连接 RNA 分子

实验材料 T4RNA连接酶供体RNA受体RNA

试剂、试剂盒 10XT4RNA连接酶缓冲液无核酸酶的水FEGRNA酶抑制剂

实验步骤

一材料与设备

1)10XT4RNA 连接酶缓冲液：50 mmol/LTris (pH7,8)，l0 mmol/L MgCl2，5 mmol/LDTT,1 mmol/L ATP

2) 无核酸酶的水

3)FEG(polyethyleneglycol)40%

4)RNA 酶抑制剂

5)T4RNA 连接酶

6) 供体（donor)RNA

7) 受体（acceptor)RNA

(二）操作方法

1) 进行 RNA 与 RNA 分子连接的反应体系如下：

供体 (donor)RNA                                              100-500ng

受体 (acceptor)RNA                                            250ng

10XT4RNA 连接酶缓冲液                                     4ul

RNasin 核酸酶抑制剂 (40U/ul)                             1ul

PEG,40%                                                             20ul

T4RNA 连接酶 (9-12U/u1)                                   1ul

补无核酸酶的水至终体积为                                 4u1

2)37℃ 孵育 30 min，或 16℃ 反应过夜.

3) 纯化回收，一 20℃ 保存。

注意事项

1) 供体（donor)RNA 分子如Poly(A)+RNA) 必须包含 5＇磷酸基团。

2)RNA 分子能有效的被多聚核苷酸激酶磷酸化。