实验材料 动物组织
试剂、试剂盒 乙酸缓冲溶液葡萄糖醛酸酶蛋白酶氢氧化钾溶液三氯乙酸甲基叔丁基醚-环己烷
仪器、耗材 离心管培养箱超声水浴硅烷化梨形瓶色谱柱
实验步骤
1. 样品提取
取充分均质的组织样品10 g于100 mL玻璃离心管中，加入20 mL 0.1 mol/L乙酸缓冲溶液，20 mg葡萄糖醛酸酶和蛋白酶，于均质器上均质1 min，置于培养箱中60培养1 min。冷却后加入15 mL 200 g/L三氯乙酸（采用广范围试纸，调pH1.5），在超声水浴上超声10 min。将提取液于10/15 ℃，4000 g离心15 min，若仍然存在悬浮物，温度可降低至8 ℃。倾出上清液，用20%氢氧化钾溶液调整pH至5.8～6.2，若在中和过程中出现沉淀，应进行过滤或再次离心。用200 g/L三氯乙酸淋洗电极，并入溶液中，并使总体积接近500 mL。移取20 mL 上述溶液于ISOLUTE HM-N柱中，平衡20 min。制备两份20 mL溶液，每份加入30 mL甲基叔丁基醚-环己烷（8 + 2），于100 mL硅烷化梨形瓶中，减压250 mbar，50 ℃旋转蒸发至干。
2. 净化
将ISOLUTE-Si汾置于SPE装置上，预先按顺序加4 mL乙酸乙酯，4 mL乙酸乙酯-甲苯（20 + 80），抽干。用2 mL乙酸乙酯-甲苯（20 + 80）溶解残渣，超声振荡，转移入柱。然后以4 mL乙酸乙酯-甲苯（20 + 80）淋洗，弃去淋洗液。用4 mL乙酸乙酯-甲苯（65 + 35）洗脱并收集氯霉素组分。
2. 衍生化
收集溶液于40 ℃在缓慢氮气流下吹干。用200 uL乙酸乙酯转移入反应小瓶，加入20 uL内标溶液m-CAP，再次于40 ℃在缓慢氮气流下吹干。加入50 uL BSTFA-TMCS（99 + 1）溶液，用内衬聚四氟乙烯（PTFE）的螺旋盖盖紧，于60 ℃反应l h。冷却后，在氮气流下缓慢吹干。加入25uL异辛烷溶解残渣。供GC-MS测定。
3. 仪器条件
色谱柱：5%苯基、95%甲基硅氧烷，30 m×0.25 mm×0.25um；
柱温：程序升温，60 ℃（l min），以40 ℃/min，升至 l80 ℃ ，以8 ℃/min， 升至280 ℃，以5 ℃/min，升至300 ℃；
进样方式：脉冲，无分流；
进样器温度: 270 ℃ ；
载气：氦气；
接口温度：300 ℃；
离子源温度：l85 ℃；
NCI离子化模式；
反应气：甲烷，压力为533 Pa（4000mTorr）；
碰撞气：氩气，压力为0.27 Pa（2mTorr）；
电子能量: 200 eV；
碰撞电流: 200 mA；
CAP：m/z 466（70）、468（70）、376（30）、378（30）；
内标：m/z 47l（70）。
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