实验方法原理
荧光素 4-单氧酶(ATP-水解)提取于萤火虫,Photinus Pyralis。
荧光素+ATP+O2→氧和虫荧光素+PPi+H2O+光
光密度 I 是和 Michaelis-Menten 等式相关的
式中,H 是 Planck 常量;v 是发射光的频率。当 ATP 浓度非常低([ATP]<<Km)时,Michaelis-Menten 等式就可以简化成:
I=常量 ×[ATP]
常量=V/Km。光密度与 [ATP] 成正比。
实验材料 荧光素酶
试剂、试剂盒 Tris-乙酸ATPMgSO4荧光素
仪器、耗材 分光光度计
实验步骤
实验所需「试剂」具体见「其他」
开始加入 0.01 ml ATP
10 s 后(25℃)读光密度值(562 nm 处的放射最大值)。利用在 0.05~0.5 umol/L 之间的 ATP 制作标准曲线。
一个酶单位被定义为,在 25℃ 甘氨酸-Tris pH 7.6 溶液中,含 5 pmol ATP 及 7.5 nmol荧光素的 50 ul 实验混合物所测量到的光输出。一个光输出单位产生一个生物计最高峰相当于在 PPO/POPOP 鸡尾酒中 14C 的 0.02 uCi(1991 年以前,1 个单位是指 pH 7.7、25℃ 时,存在 0.6 mmol/L ATP 和 0.1 mmol/L D-荧光素的条件下,每分钟能产生 1 nmol 焦磷酸的荧光素的量)。
注意事项
其他
试剂
0.1 mol/L Tris-乙酸,pH 7.75
10 mol/L ATP(二钠盐,三水合物,Mr=605.2;准备 10 mmol/L 60.5 mg 溶于 10 ml 溶液并且稀释 10 ul 于 10 ml 水中)
0.1 mol/L MgSO4(MgSO4·7H2O,Mr=246.5;246 mg 溶于 10 ml 水中)
1 mol/L 荧光素(4,5-二氢-[6-羟基-2-苯噻唑]-4-噻唑酸,Mr=280.3;钠盐,Mr=302.3;3 mg 溶于10 ml 0.1 mol/L Tris-乙酸 pH 7.75, 储存于 -20℃)。
荧光素酶(提取于萤火虫,1 ug/ml溶于 0.1 mol/L Tris-乙酸,pH 7.75)