全组织细胞色素氧化酶活性染色试剂盒产品说明书(中文版)
主要用途
全组织细胞色素氧化酶活性染色试剂是一种旨在使用细胞色素C催化人工电子供体染料二氨基联苯胺的非酶源性自然氧化,形成棕褐色不溶性产物,来分析全组织样品中细胞色素氧化酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心改良传统NADI方法、成功实验证明的。主要适用于各种动物组织的细胞色素氧化酶活性的定性检测。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,显色清晰。
技术背景
细胞色素氧化酶(Cytochrome oxidase)是氧化呼吸链的酶部分的总称。其存在于真核生物的细胞线粒体上,主要通过氧化磷酸化为细胞提供能量。二氨基联苯胺(3,3’-diaminobenzidine,DAB)是人工电子供体染料,通过与金属蛋白,例如含铁蛋白细胞色素C中的物理性结合,产生非酶源性自然氧化,同时提供电子(细胞色素C作为电子受体)于呼吸链的电子传递系统,由此呈现出颜色变化和沉积,形成棕褐色不溶性产物,且不受乙醇影响。在DAB自然氧化的同时,产生活性氧,例如过氧化氢,由过氧化氢酶防止其聚集。在大量氧化型DAB的存在下,通过细胞色素氧化酶的作用,亚铁细胞色素C被氧化成正铁细胞色素C。由此氧化型DAB棕褐色不溶性产物被用于检测组织细胞中细胞色素氧化酶的活性。
产品内容
清理液(Reagent A) 200毫升
染色液A(Reagent B1) 40毫升
染色液B(Reagent B2) 4瓶
反应液(Reagent C) 3毫升
固着液(Reagent D) 30毫升
产品说明书 1份
保存方式
保存染色液(Reagent B)和反应液(Reagent C)在-20℃冰箱里,避免光照;其余的保存在4℃冰箱里,有效保证6月
用户自备
1.5毫升离心管:用于工作液配制的容器
培养箱:用于反应孵育
中性树脂:用于切片封片
光学显微镜:用于切片染色后观察分析
实验步骤
染色开始前,将-20℃冰箱里的试剂置于室温下融化;移取9毫升染色液A(Reagent B1)到1瓶染色液B(Reagent B2)里,混匀,标记为染色工作液,置于冰槽里备用,避免光照(注意:有效期1周);继续移取2.7毫升染色工作液到新的1.5毫升离心管,加入300微升反应液(Reagent C),混匀后,标记为反应工作液,置于冰槽里,避免光照。然后进行下列操作。
准备1个6孔细胞培养板
放进新鲜切除的动物组织样本(注意:建议组织大小为0.5厘米厚,1厘米长;如果过大,最好刀切处理一下)
将组织压平
小心加入3毫升清理液(Reagent A),清洗组织样本
小心抽去清理液
小心加入3毫升反应工作液,浸没整个组织
放进37℃培养箱,孵育60分钟,避免光照
小心抽去反应工作液
小心加上3毫升清理液(Reagent A),清洗组织样本
小心抽去清理液
重复实验步骤9至10二次
小心加入3毫升固定液(Reagent D),浸没整个组织
在室温下孵育15分钟
小心抽去固定液
小心加入3毫升清理液(Reagent A),清洗组织样本
在室温下孵育15分钟
小心抽去清理液
重复实验步骤15至17二次
后续石蜡切片(6微米厚)或冰冻切片(10微米厚)
在光学显微镜下观察和计数:表达细胞色素氧化酶活性的组织细胞为阳性组织细胞,呈现棕色。
注意事项
本产品为10次操作
操作时,须戴手套
染色液(Reagent B)和反应液(Reagent C)避免反复冻融
染色工作液不宜久存,1周内使用为佳
阴性对照时,GENMEN反应工作液可含有叠氮化钠
每次更换试剂溶液时,保持切片面基本晾干
试剂溶液在切片表面时,避免有气泡存在,同时确保铺满切片表面
整个操作,在避光状态下进行
染色孵育时间,根据样品和酶活性强弱调整,通常为1至3小时
染色完成后,即刻进行光学显微镜观察
样品染色后保存,避免光照
细胞色素氧化酶活性染色参考图像:
本公司提供系列组织细胞酶活性染色试剂产品
质量标准
本产品经鉴定性能稳定
本产品经鉴定显色清晰
来源:上海一基实业有限公司
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