二苯胺DNA比色法定量测定试剂盒产品说明书
主要用途
二苯胺DNA比色法定量测定试剂是一种旨在通过二苯胺与DNA的特异性结合反应,借助可见光波长的吸光峰值的变化,比色测定样品中DNA的绝对含量或浓度的技术方法。其适用于各种原核生物和真核生物的细胞或组织DNA以及环境中DNA含量分析。产品即到即用,性能稳定,简易方便,无需样品纯化,定量准确。
技术背景
二苯胺(diphenylamine)具有与DNA酸性水解脱嘌呤后释放的脱氧核糖(deoxyribose)转变的ω-羟基菊芋糖醛(ω-hydroxylevulinyl aldehyde)特异性反应的功能,形成蓝色复合物。但不与RNA的核糖 (ribose)反应。通过可见光(600nm)吸收可以进行定量分析。因此避免了A260测定的种种限制,例如对样品的纯化要求、对DNA的单链双链的要求和对紫外光UV的需求,以及RNA的干扰。
产品内容
缓冲液(Reagent A) 8毫升
分解液(Reagent B) 8毫升
反应液(Reagent C) 25毫升
稳定液(Reagent D) 125微升
标准液(Reagent E) 200微升
产品说明书 1份
保存方式
保存稳定液(Reagent D)和标准液(Reagent E)在4℃冰箱里,其余的保存在室温下;其中反应液(Reagent C)和稳定液(Reagent D),具有腐蚀性,注意操作安全,且避免光照,有效保证6月
用户自备
1.5毫升离心管:用于样品操作的容器
恒温水槽:用于反应物孵育
比色皿:用于比色分析的容器
分光光度仪:用于样品比色测定
实验步骤
测定准备
准备好待测样品,置于冰槽里
设定好分光光度仪:波长600nm,并置零
准备好9个1.5毫升离心管,标记为1至9号管
按照下表配制标准液
放进冰槽里备用,避免光照
管号
缓冲液(Reagent A)
标准液(Reagent E)
标准DNA浓度
1
0
20微升
20微克/10微升
2
5微升
15微升
15微克/10微升
3
10微升
10微升
10微克/10微升
4
12微升
8微升
8微克/10微升
5
14微升
6微升
6微克/10微升
6
16微升
4微升
4微克/10微升
7
18微升
2微升
2微克/10微升
8
19微升
1微升
1微克/10微升
9
20微升
0
0
二、比色测定
实验开始前,小心移取6毫升反应液(Reagent C)和30微升稳定液(Reagent D)到15毫升锥形离心管,混匀后,标记为反应工作液,避免光照。然后进行下列操作。
准备至少10个新的1.5毫升离心管作为测定管:标记9个标准管和1个待测样品管
分别加入140微升缓冲液(Reagent A)到每一个标准管和样品管
分别加入10微升上述配制的标准液(Reagent E)到相应测定管里(注意:浓度和管号对号入座)
加入10微升待测样品到样品管里
分别加入150微升分解液(Reagent B)到所有测定管里
放进70℃干式恒温槽或恒温水槽孵育20分钟
在室温下静置,直至试管温度降温到室温(15至30分钟)
分别加入600微升含有反应液(Reagent C)和稳定液(Reagent D)的反应工作液到所有测定管里
放进37℃培养箱(暗室环境)孵育5小时
即刻分别移入到1毫升比色皿,放进分光光度仪读数:获得吸光读数
构建标准曲线:纵座标(Y轴)为吸光单位(OD);横座标(X轴)为标准DNA浓度(微克/10微升)
根据标准曲线获得样品对应DNA浓度(微克/10微升)
样品实际DNA浓度:
[根据标准曲线获得样品对应DNA浓度(微克/10微升)X样品稀释倍数]÷100=微克/毫升
注意事项
本产品为10次样本操作
操作时,须戴手套
系统操作时,标准样品测定只需1次
反应液(Reagent C)、稳定液(Reagent D)和反应工作液,避免光照
操作时注意安全,尤其在使用反应液(Reagent C)、稳定液(Reagent D)和反应工作液时,十分小心
待测样品无需纯化,包括去蛋白、去RNA等处理
计算实际浓度时,不要忘记待测样品的稀释倍数
使用无水乙醇清洗比色皿
本公司提供系列DNA定量分析试剂产品
质量标准
本产品经鉴定性能稳定
本产品经鉴定定量准确
来源:上海一基实业有限公司
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