最近小编在应用CRISPR/CAS9作为工具制备基因编辑细胞株,有一些阶段性总结和设想,在这里贴出来,大家可以互相探讨一下。
首先要描述一下“基因编辑细胞株”的具体要求:
(1)“基因编辑”是指在特定位点引入期望的碱基修饰。
具体过程为,通过CRISPR/CAS9在待编辑位点(靶位点)附近引入基因组DNA双链断裂(DSB)后,通过同源重组介导的修复(Homology Directed Repair,HDR)引入期望的序列改变。
(2)无痕编辑。
即在得到的基因编辑细胞株中,除待编辑位点外,细胞株基因组不发生变化。
(3)纯合子。
即对于得到的细胞株中,所有单个细胞对于所包含的几套染色体(对于肿瘤细胞,多数情况为异倍体),靶位点均发生特定碱基修饰。
目前为止小编只想到3条(其实这3条就足以让人眉头紧蹙了),欢迎在留言区补充!
下面,小编分几个方面罗列目前的一些总结或设想,权作抛砖引玉,继续欢迎大家在留言区轻拍讨论。
第一方面:同源模板
1)不采用ssODN(single-stranded donor oligonucleotides)。
有一原则,即要引入的突变序列越长,需要的同源臂越长。
原本ssODN对于点突变等小范围修改是非常便利,但小编还是准备忍痛割爱。
因为效率低(得到突变纯合子的平均中位值约2%),且ssODN难以引入筛选标签,只能通过PCR的方法盲筛。对于转染效率低的细胞,采用ssODN往往事倍功半。
2)使用Donor质粒,且需要有阳性和阴性筛选Marker
● Donor质粒结构如下:
阳性筛选Marker:加药后,含有此基因的细胞存活。
阴性筛选Marker:加药后,含有此基因的细胞凋亡。
● CAS9切割基因组产生DSB后,Donor质粒介导基因组的插入:
此时加入阳性筛选药物,去除未发生HDR的细胞。
●之后转染表达转座酶的质粒,图中绿色PB及中间序列被无痕切除,修饰完成:
此时加入阴性筛选药物,去除无痕切除不成功的细胞。
在此基础上,再通过PCR的方法筛选纯合子,效率可以提高至25%左右。
3)适当延长donor质粒左右臂长度
突变片段越大,需要的左右臂长度越大,一般在600到2000之间。
4)防止CAS9二次切割
在donor质粒上,需要将对应sgRNA的PAM或邻近PAM的序列进行同义突变,以防止donor质粒插入基因组前后被CAS9识别并切割。
5)扩增左右臂的模板选择要慎重
左右臂需要以待突变的目的细胞基因组为模板扩增,避免不同细胞基因组差异导致左右臂不同源,降低HDR效率。
6)质粒构建难度大
构建donor质粒需要线性化质粒、左臂、插入片段、右臂4段片段连接,建议采用Gibson法。
7)质粒质量要求高
质粒纯化后浓度需要高于1ug/ul。
第二方面:CRISPR/CAS9切割
1)避免脱靶
sgRNA设计避免脱靶。
采用nick形式的CAS9加双sgRNA,实际切割效率不低,且避免脱靶。
2)sgRNA贴近编辑位点
CAS9切割位置在待修饰位点的30bp以内,最差保持在50bp以内。
3)保证sgRNA活性
sgRNA活性是影响KI的关键因素之一,因此需要提前验证其活性。
4)CAS9形式选择
缩短CAS9蛋白在细胞内的存续时间,可以避免连续切割和脱靶,建议使用mRNA或蛋白形式的CAS9。若采用质粒,需要确保其纯度和浓度(建议大于1μg/μl)。
第三方面:对细胞的要求
1)细胞需保真
制备一株基因编辑细胞株所需要的时间、人力和金钱成本都是较高的,前提是细胞必须STR验证通过。
2)提前确定靶位点序列
所有操作前,对待修饰的细胞需要提前测序了解靶位点的序列。
3)预实验确定细胞特性
需要提前确定细胞最优转染方式、单克隆形成能力及筛选药物的最适浓度。
此文写罢,才疏学浅,心下惴惴,盼在留言区见各位高论!
文献参考
1. PMID: 27709569.CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis of Human Pluripotent Stem Cells in Defined Xeno-Free E8 Medium.
2. PMID: 26748756. Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells: Approaches, Pitfalls, and Solutions.
3. PMID: 27532820. Comprehensive Protocols for CRISPR/Cas9-based Gene Editing in Human Pluripotent Stem Cells.
4. PMID: 22189101Concerted nicking of donor and chromosomal acceptor DNA promotes homology-directed gene targeting in human cells.