高等生物体内一般有105个基因,在这些基因中通常只有不到15%的基因得以表达,并且在生命代谢的不同阶段,在不同的环境条件下有不同的基因表达,基因表达差异性是生物体性状多样性,适应能力多样性的物质基础。对同一品种在不同环境条件下的基因差异表达研究,可以了解基因与性状间的关系,并进一步确定一些特殊的基因,dd-PCR技术是进年来发展起来的基因差异表达研究的手段之一。该技术利用mRNA3’端具有poly(A)的特点,以T12G、T12C、T12A为3’端引物扩增出cDNA;以10-mer的随机引物为5’引物进行PCR扩增,mRNA不同,随机引物结合位点不同,扩增后的条带长度也不同,通过测序胶电泳即可将差异表达的mRNA找出,进一步通过克隆或作为探针进行杂交即可获得差异基因。
一:仪器:PCR仪、电泳仪、测序槽、银染设备
二:试剂:T12G、T12C、T12A、10-mer的随机引物、RT-PCR试剂盒、测序胶、银染系统
三:操作:1:总RNA挑取见实验二
2:残留DNA的去除
(1) 按下表整备(2) 反应体系
1-5ugRNA
10×DNA酶缓冲液 2ul
RNA酶抑制剂 1ul
无RNA酶的DNase 1u
加DEPC水 至 20ul
混匀, 37℃ 15min 等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次,0.3V3M乙酸钠,2V无水乙醇沉淀,冷冻干燥3:RT 5×RT缓冲液 4ul
0.2ug总RNA
10umT12N 1ul
加DEPC水 至 10ul
80℃ 1min 42℃ 5min 再加入
10mMdNTP 2ul
100mMDTT 1ul
50nMMgCL2 1.3ul
RNA酶抑制剂(40u/ul) 1ul
MMLV(200u/ul) 1ul
加DEPC水至 20ul
37℃ 1小时, 90℃ 1min
4:PCR 上述RT液 4ul
10×PCR缓冲液 1ul
25mM MgCL2 1ul 94℃ 1min
10mMdNTP 0.4ul 94℃ 30’
dT12M 0.2ul 40℃ 30’ 40循环
10mer随机引物 0.2ul 72℃ 45’
水 3.9ul 72℃ 6min
Taq酶(5u/ul) 0.1ul
混匀后,离心,再加上10ul石蜡油,按右边参数扩增。
5:检测 龈染检测,操作见实验十五
6:差异带切割、回收操作见实验八
7:回收差异带二次扩增
回收的差异带稀释 50-100倍
10×PCR缓冲液 1ul
25mM MgCL2 1ul 94℃ 1min 94℃ 45’
10mMdNTP 0.4ul 94℃ 45’ 42℃ 45’
dT12M 0.2ul 40℃ 45’ 72℃ 60’
10mer随机引物 0.2ul 72℃ 60’ 20循环
加水至 10ul 20循环 72℃ 6min
Taq酶(5u/ul) 0.1ul
8:PCR片断的再回收和克窿操作