（一）材料与方法
1. 生物素标记特异性抗体的制备
基存免疫球蛋白（如IgG、IgM）的Fc片段上有糖在，因而可用能与糖基结合的Biotin-hydrazide作生物素标记。
（1） 将纯化的抗体（IgM或IgG， 0.1~1.0ml）在标记缓冲液（0.1Mol/L NaAc，pH值5.5， 0.1Mol/L NaCl）中4℃透析过夜。
（2）吸取0.5ml至微量离心管中，加过碘酸钠溶液至终浓度为10mMol/L，置冰浴上于暗处孵育30min，使抗体分子上的糖基氧化。
（3）将氧化的抗体过PBS平衡的Sephadex G25 PD-10预装柱，使之与过碘酸钠分开。收集蛋白峰。
（4）向抗体管中加入Biotin-LC-hydrazide(Pierce)至终浓度5mMol/L，置混摇器上室温孵育1h。
（5）用含0.02%NaN3的PBS平衡Sephadex G25预装柱，将生物素标记的抗体分子过柱与游离的生物素分开。收集蛋白峰，保存-20℃。
2. 生物素标记DNA片段的制备
作为将与抗体偶联的报告DNA片段，应确保在待测抗原来源的机体DNA中无同源序列，如可选用大肠杆菌的序列作为报告DNA去检测人源的标本。
DNA片段大小为300~500bp，生物素标记可采用PCR方法，根据报告DNA的核苷酸序列合成一对引物，其中一个引物的5’端碱基上带有生物素标记。在0.5mlPCR管中按表将下列试剂混合。
表PCR系统组成
试 剂 添加量 终浓度
10×PCR 缓冲液 10.0ul 1×
2.5mMol/L 4dNTP混合物 8.0ul 0.2mMol/L
50uMol/L生物素标记的上游引物 1.0ul 0.5uMol/l
50uMol/L生物素标记的下游引物 1.0ul 0.5uMol/l
15mMol/L模板 DNA 1.0ul 1.0ug
Taq DNA聚合酶1.0ul 5U
加水至 100uL
混匀后上面覆盖液体石蜡。
95℃加热5min，然后在PCR仪上按下列程序扩增：94℃ 1min;55℃ 1min; 72℃ 1min;
40个循环。最后72℃延伸10min。加等量酚-氯仿抽提，然后加10ul 3Mol/L Kac，250uL无水乙醇，置-70℃
30min。离心沉淀DNA片段，用70%乙醇洗一次。 将沉淀DNA干燥后溶于TE缓冲液中，保存在-20℃。
3. 制备抗体-亲和素-DNA复合物 子浓度的生物素标记的DNA片段，继续孵育30min，最后加入10倍分子浓度的生物素，将亲和素分子上的结合部位饱和。最后过凝胶过滤柱将复合物与未结合的单体分开，加入BSA达 1mg/ml，分装后冻存于-20℃。
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