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放射免疫分析(RIA)中影响标准曲线建立的因素(二)

2020.9.01
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王辉

致力于为分析测试行业奉献终身

(七)其它

试剂盒必须在有效期内使用,不同批号的试剂不得混用。试剂盒从冰箱取出后,应平衡至室温后使用。加样前必须彻底颠倒混匀所有试剂,特别是分离剂。所有冻干品复溶10-15min后方可使用。
二、加样过程

(一)人员

操作人员上岗前要经过基础理论和基本操作技术培训,包括通过加样一致性考核,加样误差要<2%,要严格按各药盒的说明书进行操作,防止由于工作人员情绪波动、草率和不遵守操作规程所造成的误差,由于操作精度随检查管数增加而下降,每人每天操作以不超过500管为宜。

(二)试管

质要地均匀,表面光洁度好,非特异性吸收低,不能沾有放射性核素,使测定放射性的自吸收和几何位置容易一致。

(三)加样

加样时量要尽量精准(特别是在加标记抗原时)加样器经长时间使用后弹簧的弹性及密封性会降低,影响其准确性,要经常校准加样器。为减少误差,加标准品与加样品时要使用同一加样器,要避免加标记抗原和抗血清时通过管壁及吸管尖的粘附而相互污染。同时应使用一次性吸量用具。不能随意颠倒标本、碘标记物和抗体的加入顺序。加样倾斜角度应一致,并根据需要选择正向或反向加样。

(四)每批试验必须同时建立标准曲线,不主张调用标准曲线,若调用以前所做标准曲线将造成整批测定结果的偏高或降低。特殊情况确需调用标准曲线,可用药盒附带质控品及患者正常样品标本进行严格质控方可,此外各浓度标准品应设2—3支复管,标本也最好设复管(切不可嫌麻烦),这是减少误差的重要保证。

三、测量仪器

要使用效率高、本底低,稳定性好的放射性测量仪器,并要采用足够的测量时间。放免计数仪应经常维护和保养。测量时试管上部的内外壁应干燥,以防探头污染。探测器最佳工作条件的选择可以制定出较好的标准曲线,从而获得可靠的测量结果,选择工作条件的方法通常有坪曲线测定或品质因素测定。

(一)坪曲线测定

探测器的光电倍增管必须在一定的高压状态下才能工作,这种高压应选择在电压发生少许波动时,对计数率影响较少的高压值,该高压值的选择是通过坪曲线来确定的,从多次测量的结果中,选出坪段较长且斜率较小的曲线,取该曲线坪段前1/3处所对应的高压值为工作电压 。

(二)品质因素测定

样品作相对计数测量时希望得到高的样品计数率和低的本底计数率,而样品计数率和本底计数率的关系是:品质因素(F)=E2/nb(E为测定效率,IIb为本底计数率)F越高,在该测量条件下,能获得较高的样品计数率和较低的本底计数率。应用坪曲线测定与品质因素测定,后者考虑因素较多,结果更为可靠。

四、曲线拟合模式

同一剂量反应曲线可以用不同的模式进行拟合,稍加比较可见其拟合程度好坏不一,并不是拟合程度越复杂越好。相关系数R2可做评价拟合精度的指标,R2越趋于1,拟合精度就越高,要求R2>0.990。DEV%是拟合百分比偏差,由此可看出每一标准品点的偏离情况,一般要求 DEV%<10%,曲线拟合优度的常用指标为R2和DEV%。

应特别强调的是:对曲线的拟合,只是对由标准品及其相应的反应参数所决定的曲线段进行数学处理,在标准品给定的区间范围内,拟合的函数关系应保证其单调性,曲线拟合不能外推。同时应注意,无论用什么方法进行拟合,都不可能将坏的结果变为好的结果。只有把好实验关,才能真正提高实验结果的精度

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