室温下充分混匀，离心10000g×2min。取上层液置另一0.5 ml离心管中，加入100μl氯仿，混匀，离心10000g×2min。将上层液转移至另一0.5ml 离心管中，再加入3M NaAc 10μl、预冷无水乙醇250μl，混匀后，-20OC静置30min。4OC离心13500g×10min。弃上清液，沉淀用75%乙醇100μl洗涤，4OC离心13500g×2min, 弃上清液。室温下挥发残留乙醇。加入50μl杂交缓冲液溶解沉淀，4OC下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测探针质量。（参见本节电泳步骤）。
2．杂交
（1） RNA提取后溶解在杂交缓冲液中，浓度为1μg/μl。
（2）取8μl RNA加入1-3μl探针（根据探针检测结果调整）于0.5ml 离心管中。
（2） 80OC保温2min，然后40-45OC下杂交12-18hr。
3. 消化
(1) 杂交管于37 OC保温15min，加入RNase消化液，37 OC保温30min。
(2) 加入10%SDS 10μl、10μg/μl蛋白酶K 20μl，混匀，37 OC保温10min。
(3) 加入65μl饱和酚和65μl氯仿，混匀，室温离心，10000g×2min。
(4) 转移上层液到另一0.5离心管中，加入10μl酵母tRNA和3M NaAc 15μl，再加入200μl异丙醇，混匀后，置-20OC 30min，4 OC离心,135000g×10min。
(5) 弃上清液，室温下挥发乙醇，加入5-8μl上样缓冲液溶解沉淀。
4、电泳与放射自显影
（1）配制凝胶：(50ml)
40%丙烯酰胺-亚甲双丙烯酰胺（19：1） 6.25ml
5×TBE 10ml
尿素 24g
加 H2O至50ml
溶解后加入25%过硫酸胺50μl，TEMED 50μl，混匀，注入电泳槽中，插入梳，待胶凝固。
（2）预电泳
以1×TBE为上下槽电泳缓冲液，加上电压后进行预电泳，如果用测序电泳装置，电压应达2000v以上，功率设定为100w，温度设为50 OC。待胶板温度达50 OC时，暂停电泳，准备加样。
（3）加样
将已溶解在加样缓冲液中的样品80 OC加热2min，立即加样到胶孔中，电泳1-2hr。（电泳条件同预电泳）。
（3） 电泳结束后，打开胶板，用滤纸取下胶，覆上一层保鲜膜，放置于暗盒中，暗室红光下，压上一张X片，盖上暗盒，-70OC曝光1-3天。暴光结束后，将X光片显影、定影、水洗、晾干。
三、注意事项
1．本实验大部分为RNA操作，注意RNA酶的污染。
2．RNase消化液消化未杂交的单链RNA和探针RNA，当探针与样品之间有碱基错配时，错配位点也将被消化，因此会产生片段较小的杂交片段。因此进行PCR时，采取尽量减少错配的措施。
3、 同位素对RNA合成有一定影响，有时会产生非全长的探针。因此，标记时间不宜过长。
4、 RNase消化液有时会产生过度消化而无检测信号，可以将消化液稀释10-100倍后使用。
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