6、血清的有关问题:
新生牛血清:新出生牛5天内取血制成
小牛血清:小牛出生16周以内采血制成。
胎牛血清:(进口血清)要求剖腹取胎制成。
国内厂家往往不能做到,经常把出生2天以内采血称为胎牛血清。
根据血清的生产工艺及血红蛋白、内毒素含量又分为:
(1)特级胎牛血清:40纳米过滤,内毒素含量≤10EU,
血红蛋白含量≤10mg/dl。
(2)优等胎牛血清:经过3次100纳米过滤,
内毒素含量≤25EU/ml,
血红蛋白含量≤25mg/ml。
(3)标准胎牛血清:3次100纳米过滤,低内毒素,低血红蛋白含量。
(4)活性碳/葡聚糖处理血清:激素含量大大降低。
(5)透析型胎牛血清:次黄嘌呤和胸腺核苷含量大大降低。
7、培养基在使用过程中应注意的问题:
(1)培养基在使用前需37℃预热或在室温平衡后再使用。
(2)细胞培养过程中,吸取过培养液的吸管不能再用火焰烧灼,防止残留在吸管内的培养基焦化,将有害物质带入培养液中。
(3)尽量缩短各种液体、细胞的暴露时间。
(4)避免液体间、细胞间的交叉污染。
(5)配制完全培养基时,配制的量最好在2周内用完为好。
8、其他细胞培养用液:除培养基、血清、谷氨酰胺外,其他几种液体也属必须,不可省略。
(1)双抗:200倍,(1ml/支)其终浓度为青霉素100U/ml;链霉素100ug/ml,-24℃保存。
(2)L-谷氨酰胺:100倍,(1ml/支), 终浓度2mM,-24℃保存。
(3)丙酮酸钠:配制浓度50mM,4ml/支,终浓度为1mM/ml,-24 ℃保存。
(4)Hepes液:配制浓度1M(5ml/支),一支Hepes加入到200ml完全培养基中,终浓度为25mM/ml,常温保存。
9、支原体污染及检测:
(1)支原体污染在细胞培养中最常见、不易被查觉,但支原体污染可显著影响细胞功能干扰实验结果。支原体是介于细菌和病毒之间的目前所知能独立生活的最小微生物,它无细胞壁,形态呈高度多形性,最小直径0.2um,可通过滤器。
目前中心通过对国内100余株/系细胞的检测,形势不容乐观。污染率达30%~60%
。课题组从国外引进细胞株/系也经常出现支原体的污染。支原体在污染细胞后,它通过影响细胞的DNA、RNA
的合成及急速消耗培养基中的氨基酸来抑制细胞的生长,并能降低细胞的融合率。因此,在运用各种细胞系进行实验研究时,首先要证明所用细胞有无支原体的污染。
(2)支原体污染后,培养基可不发生浑浊,细胞病变轻微或不明显,因此难以发现。目前,支原体检测的方法有以下几种。
(a)相差显微镜观察;
(b).低张处理地衣红染色法;
(c)荧光染色法;
(d).酶标法;
(e)PCR法:基础医学细胞中心使用该方法进行检测。
优点:灵敏度高,检测耗时短,样品量小(只需50ul细胞培养用液上清)。
缺点:引物及制剂费用较高。