【实验目的】
了解聚合酶链反应(PCR)的基本原理及其影响因素,掌握PCR的基本操作过程。
[仪器]
PCR仪、台式离心机、电泳仪、电泳槽、紫外检测仪
[试剂]
1、引物:用去离子水配成10 μmol /μL。
2、Taq聚合酶
3、10×PCR反应缓冲液(加镁离子)
4、dNTPs:四种核苷酸混合物,浓度为10mM
5、模板:含有R基因片段的重组cDNA的质粒
6、1%琼脂糖凝胶
7、50 ×TAE电泳缓冲液(1000 mL)
Tris 242 g,Na2EDTA.2H2O 37.2 g, 溶于600 ml 去离子水中;加冰乙酸57.1 ml, 最后用去离子水定容至1000 mL。
8、6× 上样缓冲液
0.25% 溴酚蓝;0.25%二甲苯睛蓝,30%甘油,溶于水中,4℃保存。
[实验步骤]
1、反应混合液的配制:在一个0.5mlPCR管中加入下列成分:
两种引物(各) | 2μl |
10×PCR 缓冲液 | 10μl |
dNTPs | 2μl |
模板 | 1μl |
Taq酶 | 0.5μl |
去离子水 | 补至100μl |
充分混匀,离心片刻,使液体沉至管底。
实际操作时,先根据所需进行的反应数,配制反应混合物(按上述配方,不含模板)。每组进行3 个反应,需配制76微升反应混合物,则按上述配方的4倍进行配制。然后分装于4个PCR管中,每管19微升。其中3管每管加入1微升模板,另一管加入1微升水,作为对照。
2、PCR反应条件
循环1:94℃,3分钟;循环2-31:94℃变性45s、52℃退火45s、72℃延伸1min;共30个循环;最后72℃延伸10分钟。
3、反应结束后,取5微升反应产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳分析,其余置4℃保存备用。
(1)用1 x TAE缓冲液配制琼脂糖凝胶:在电子天平上准确称取琼脂糖0.2g,倒入100 ml三角瓶,加入20 mL缓冲液。
(2)微波炉上加热40S。
(3)待冷却至60℃左右时,加入1μL溴化乙啶,摇匀。
(4)将凝胶倒入预先准备好的制胶板上,插入梳子,待冷却。
(5)取5微升PCR产物在1%琼脂糖胶上电泳:80V,20min。
(6)取出凝胶,在紫外灯下观察,记录观察结果。
3、PCR产物的纯化
(1)向PCR产物中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1,v/v),混匀;
(2)14 000 r/m 离心5min;
(3)取上清液,再加等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1,v/v),混匀;
(4)14 000 r/m离心15 min;
(5)取上清液,加入1/10体积的3M NaAc (pH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇,混匀,-20℃放置2 h或过夜。
(6)4℃,14 000 r/m离心15 min,弃上清液;
(7)沉淀用70%乙醇洗涤1次;
(8)14 000 r/m离心10 min,弃上清,风干。获得纯化的PCR产物。
[注意事项]
由于PCR灵敏度非常高,所以特别需要防止反应混合物受到DNA的污染,因此在实验中应注意下列事项:
1、所有与PCR有关的试剂,只作PCR实验专用,不得挪作它用。
2、操作中使用的PCR管、离心管、吸头等,只能一次性使用。
3、特别注意防止引物受到用同一引物扩增的DNA的污染。所有试剂,包括引物,应从母液中取一部分稀释成工作液以供平常使用,避免污染母液。