多聚酶链式反应技术（PCR技术）(1)

多聚酶链式反应即PCR（polymerase chain reaction）技术，应用这一技术可以将微量目的基因（DNA片段）扩增一百万倍以上。PCR反应理论的提出和技术的完善对于分子生物学的发展具有特殊的意义，它以敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等优点迅速成为分子生物学研究中应用最为广泛的方法之一，并使得很多以往无法解决的分子生物学研究难题得以解决。发明这一技术的K. Mullis因此贡献而获得了1993年度诺贝尔化学奖。

一、PCR技术的工作原理

PCR的基本工作原理是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5'末端和3'末端互补的寡核苷酸片段为引物（primer），在耐热DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA分子合成。重复这一过程，即可使目的DNA片段得以大量扩增（图14-1）。

组成PCR反应体系的基本成分包括：模板DNA、特异性引物、耐热DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）、dNTP以及含Mg2＋的缓冲液。

PCR的基本反应步骤包括：（1）变性：将反应体系加热至95℃，使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身以及引物之间存在的局部双链也得以打开；（2）退火：将温度下降至适宜温度使引物与模板DNA退火结合；（3）延伸：将温度升至72℃，耐热DNA聚合酶发挥酶活性，以dNTP为底物催化DNA的合成反应。上述三个步骤构成一个循环，新合成的DNA分子继续作为下一轮合成的模板，经多次循环（25～30次）后即可达到扩增DNA片段的目的。

二、PCR引物的设计

PCR反应成功的一个关键条件是正确设计引物。好的引物设计可以避免非特异产物的产生，也极大地影响着扩增产量。当然，有了好的引物，依然需要进行反应条件的优化。然而如果不遵守引物设计的基本规则，即使改变反应条件也不会有什么好效果。

引物设计需要在扩增特异性和扩增效率两方面目标上取得平衡。目前，可利用计算机软件方便地进行引物设计，引物设计软件会通过每一引物设计变化的预定值在两个目标间取得平衡，找出最佳引物。不过，我们也须根据实验具体要求进行适当调整（如在医学诊断中，可以以牺牲效率为代价调整引物以提高特异性，因为在临床诊断中避免假阳性比产生大量扩增产物更重要）。以下是引物设计的几项基本原则。

1. 引物长度　在16～40 bp范围内，以18～24 bp最佳。引物过短，会降低产物的特异性，每增加一个核苷酸，引物特异性可以提高4倍。注意，这里引物的长度是指与模板DNA序列互补的部分，并不包括为后续克隆而加的酶切位点等额外序列。引物过长，会使退火过程不完全，与模板结合不充分，以至引起扩增产物的明显减少。

2. 引物末端　引物的3'末端对PCR反应是非常关键的。由于引物3'端的第一和第二个碱基影响Taq DNA聚合酶的延伸效率，因而会影响PCR反应的扩增效率及特异性。引物的最好选T、G、C而不选A；同时，引物的3'端应该为保守氨基酸序列，即采用简并密码少的氨基酸如Met、Trp，且要避免密码子第三个碱基的摆动位置位于引物的3'端。

对于引物5'末端的碱基并无严格限制。当引物长度足够时，引物5'端的碱基可不与模板DNA互补结合而呈游离状态。因此可在引物5'端加限制性内切酶位点、启动子或其他序列等，以便于PCR产物的分析、克隆。引物5'端最多可加到10个碱基而对PCR反应无影响。

一对引物之间可能存在互补序列，特别是3'末端应尽量避免互补，以免形成“引物二聚体”造成引物浪费和非特异扩增。每一个引物的内部也应尽量避免形成二级结构，特别是引物的末端应无回文结构。

3. 引物G＋C含量和Tm值　引物G＋C含量应该保持在40%～75%之间。G＋C含量50%的20个碱基寡核苷酸链的Tm值约在56℃～62℃范围内。在此范围内，既可以保证有效退火，又维持了良好的特异性。一般引物设计软件在核苷酸序列确定后即可算出引物的Tm值、检查有无引物二聚体以及回文结构等。

4. 引物的位置　引物的序列应位于基因组DNA中的保守区，且与非扩增区无同源序列，这样可以减少引物与基因组的非特异结合，提高反应特异性。若是以cDNA为模板，则首先应尽力使引物和产物保持在mRNA的编码区域内。其次，尽量把引物放到不同的外显子上，以便使特异PCR产物与从污染DNA中产生的产物在大小上相区别。

三、PCR的基本操作步骤及条件优化

1. 基本操作步骤　PCR反应基本步骤是在反应管中加入PCR反应缓冲液、dNTP、引物、DNA模板和耐热DNA聚合酶，混匀后加石蜡油封盖防止反应液的挥发（目前有些PCR仪在无特殊要求时可不用石蜡油封），然后将反应管置于PCR仪中开始以下循环反应。①变性（Denature）：模板DNA在95℃左右的高温条件下氢键断裂，双链DNA解链成为单链DNA并游离于反应液中。②退火（Annealing）：人工合成的两条寡核苷酸引物在适当温度下分别与模板DNA扩增区域的两端按碱基互补配对结合，此时，DNA聚合酶便可开始合成新链。由于添加的引物分子数远大于模板DNA的分子数，因此引物与模板DNA形成复合物的几率远远高于DNA分子自身的复性。③延伸（Extension）：在4种dNTP底物及Mg2+存在的条件下，耐热DNA聚合酶在最适温度下将单核苷酸按碱基互补配对原则从引物的3'端掺入，使引物沿5'→3'方向延伸合成新股DNA。每一循环的产物再作为下一循环的模板。

整个PCR反应一般须进行30轮的循环。在最初的循环阶段，原来的DNA链起着模板的作用，随着循环次数增加，新合成的引物延伸链急剧增多而成为主要模板，因此PCR扩增产物将受到所加引物5'末端的限制，使终产物序列介于两种引物5'末端之间的区域。

2. 条件优化　PCR方法操作简便，但影响因素颇多，因此需要根据不同的目的及不同的DNA模板，探索最适条件，以获得最佳反应结果。以下主要从反应的特异性、敏感性、忠实性及扩增效率等四个方面讨论PCR反应条件的优化。

（1）PCR反应循环参数：①变性：变性温度过高或变性时间过长都会导致耐热DNA聚合酶活性的丧失，从而影响PCR产物的产量。但变性温度过低或变性时间过短则会导致DNA模板变性不完全，使引物无法与模板结合，同样会导致PCR反应的失败。通常情况下，95℃变性20～30 s即可使各种DNA分子完全变性。②退火：引物与模板的退火温度由引物的长度及G＋C含量决定。退火温度一般应比Tm值低3℃～12℃（5℃为宜，但不应超出15℃）。增加退火温度可减少引物与模板的非特异结合，提高PCR反应的特异性；降低退火温度则可增加PCR反应的敏感性。退火时间一般为20～40 s，时间过短会导致延伸失败；时间过长则易产生引物二聚体或导致非特异性配对。③延伸：延伸温度取决于所用耐热DNA聚合酶的最适温度，通常为70℃～75℃，一般不随意更改。延伸时间取决于扩增片段的长度：目的片段小于500 bp时，延伸时间为20 s；目的片段在500～1200 bp时，延伸时间需40 s；目的片段大于1200 bp则还需增加延伸时间。另外，还可以500 bp/30 s为基准，根据目的片段长度计算反应时间。目的片段小于150 bp时甚至可以省略延伸步骤，因为退火温度下DNA聚合酶的活性已足以完成短序列合成。④循环次数：主要取决于模板DNA浓度，一般为25～35次，此时PCR产物的积累即可达到最大值。在得到足够产物的前提下应尽量减少循环次数。