（二）质粒的大量制备:
1.将5ml转化菌种接种于500ml LB培养液(含用于筛选的抗生素)中，37℃以225rpm速度振荡培养12～16小时；
2.10,000rpm，4℃离心15min收集菌体；
3.将细菌悬浮于100ml预冷的STE（0.1M NaCl，10mM Tris.Cl，pH8.0，1mM EDTA，pH8.0）中，12,000rpm离心收集菌体；
4.将菌体悬于10ml细菌悬浮液中，再移至50ml离心管中；
5.加入1ml用10mM Tris.Cl (pH 8.0)新鲜配制的溶菌酶溶液(10mg/ml)，混合后室温孵育30min；
6.加入15ml新鲜配制的细胞裂解液，上下颠倒混合直至溶液变黏稠为止；
7.加入10ml预冷的中和液，上下颠倒混匀，冰浴10min；
8.12,000rpm，4℃离心20min；
9.将上清通过四层消毒纱布滤入另一50ml离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，室温放置10min，12,000rpm，室温离心5min；
10.弃上清，于沉淀中加入水和RNase，置室温30min，然后用氯仿/异戊醇(24:1)抽提一次，于上层水相中加入0.1倍体积3M NaAC（pH5.2）和2.5倍体积无水乙醇，-20℃ 沉淀15min，12,000rpm离心15min；
11.弃上清，用75%乙醇室温洗一次，12,000rpm，离心10min；
12.弃上清，真空干燥或自然干燥质粒DNA；
13.加适量去离子水或TE缓冲液(pH8.0)溶解质粒DNA，-20℃保存备用。
四、 DNA酶切，电泳分离与片段的回收
【实验目的】
掌握常用限制性内切酶的作用特点以及使用方法。
掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的操作与DNA片段的回收。
【实验原理】
目的DNA被限制性核酸内切酶水解后产生大小不同的DNA片段，这些DNA片段在一定浓度的琼脂糖凝胶电泳上可以按分子大小不同而分开，并可以用不同的方法再把这些DNA片段从琼脂糖凝胶上回收回来。
限制性核酸内切酶水解DNA的活性与酶的单位数，缓冲液的离子强度和反应温度有关。
【实验试剂与器材】
限制性内切酶
10×内切酶缓冲液
琼脂糖
（一）DNA分子的酶切消化
【实验方法与步骤】
DNA分子用限制性内切酶消化，通常按下列比例进行：
双蒸馏水 适量
10×内切酶缓冲液 1/10体积
DNA 1μg
限制性内切酶 1/10体积 (DNA用1-10U)
总体积 混匀后37℃温育 30～120min
（二）DNA酶切片段的琼脂糖凝胶电泳
【实验原理】
核酸在pH高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。琼脂糖凝胶具有多孔的网状结构，以其为介质进行电泳时，不同大小的核酸可借凝胶的分子筛作用而得以分开。用溴化乙啶染色后，在紫外灯下，可见橘红色的核酸条带。琼脂糖凝胶常制成水平平板状，电泳缓冲液覆盖在平板表面，加样后，通电进行电泳，故称为潜水式电泳。
【实验试剂与器材】
1.５×TBE: 54g Tris碱，27.5g硼酸，20ml 0.5mol/L EDTA(pH 8.0)，配1升。
2.0.5xTBE: 取5×TBE 作10倍稀释
3.溴化乙啶液： 10mg/ml水
4.６×载样缓冲液： 0.25%溴酚蓝，40%(W/V)蔗糖水溶液
【实验方法与步骤】
1.铸胶 1g琼脂糖加0.5xTBE缓冲液100ml，在微波炉上加热融化，冷却至放在手背不觉烫手（约50℃）后，倾入架有样品孔形成器（梳子）的微型水平电泳槽中。胶液固化后，倒入0.5xTBE至高出胶面1～2mm，拔出梳子，接好电源线（注意正负极）。
2.加样 核酸样品中加入样品体积1/6的6x载样缓冲液，混匀后，用移液器加入样品孔内。
3.电泳 接通电源，施加的电压应小于5v/cm，待溴酚蓝跑至适当位置时，关闭电源。
4.染色和结果观察 向微型电泳槽内滴加溴化乙啶液，至终浓度约为0.5μg/ml，混匀后放置约30min，在254nm紫外灯下观察电泳结果，做好记录。
【注意事项】
1.溴化乙啶是致癌剂，并有中度毒性，实验中要戴防水手套，不要污染环境。紫外灯下观察结果时，应戴防护眼镜。
2.也可将溴化乙啶预先加入琼脂糖中，使浓度达0.5μg/ml进行配胶。
3.琼脂糖的浓度一般用0.8%~1.2% ,可随欲分离核酸分子的大小作调整，分子大用低浓度凝胶，分子小用高浓度胶。分离RNA时要用变性胶。
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