实验原理
核酸及其衍生物,核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收UV的性质,其吸收高峰在260nm波长处。核酸的摩尔消光系数(或称吸收系数)用来表示。为每升溶液中含有1克原子核酸磷的光吸收值(即A值)(表)。测得未知浓度核酸溶液的A260nm值,即可以计算出其中RNA或DNA的含量。该法操作简便,迅速,并对被测样品无损,用量也少。
核酸摩尔消光系数及相应光吸收值
ε(P) |
含磷量 /(%) |
A260nm |
|
pH7,260nm |
1μg/mL |
||
RNA |
7700-7800 |
9.5 |
0.022-0.024 |
DNA-Na盐 |
6600 |
9.2 |
0.02 |
(小牛胸腺)
蛋白质也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处,在260nm出的吸收值仅为核酸的1/10或更低,因此对于含有微量蛋白质的核酸样品,测定误差较小。RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上;DNA的260nm与280nmx吸收的比值则在1.9左右,当样品中蛋白质含量较高时,比值下降。若样品内混在有大量的蛋白质和核苷酸等吸收紫外光的物质,应设法先除去。
试剂和器材
一、试剂
钼酸铵-过氯酸沉淀剂:取3.6mL 70%过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4mL蒸馏水中,即成0.25%钼酸铵-2.5%过氯酸溶液。
5-6%氨水:用25-30%氨水稀释5倍。
二、测试样品
RNA或DNA干粉。
三、器材
移液管0.5mL(×2),2mL(×3);容量瓶50mL(×3);离心机;冰浴;分光光度计。
操作方法
1.准确称取待测核酸样品0.5g,加少量0.01mol/L NaOH调成糊状,再加适量水,用5-6%氨水调至pH7.0,定容至50mL。
2.取两支离心管,甲管加入2mL样品溶液和2mL蒸馏水,乙管加入2mL样品溶液和2mL沉淀剂。混匀,在冰浴上放置30min。
3.在3000r/min下离心10min。从甲、乙两管中分别吸取0.5mL上清液,用蒸馏水定容至50mL。选择厚度为1cm的石英比色杯,在260nm波长处测定A值。
二、计算:
式中,为甲管稀释液在260nm波长处A值减去乙管稀释液在260nm波长处A值;
L──比色杯的厚度,1cm;N为稀释倍数;
0.024──每毫升溶液内含1μgRNA的A值;
0.020──每毫升溶液内含1μgDNA钠盐的A值。
核酸%=
在本实验中,1mL待测液中制品量为50μg。