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免疫复合物(immune complexes)的几种测定方法(2)

2020.9.14
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王辉

致力于为分析测试行业奉献终身

2、C1q固相法测定免疫复合物

基本原理 将待检血清加入包被有C1q的微量反应板中,待检血清中免疫复合物和C1q结合,再与酶标记抗人IgG反应,通过底物颜色的深浅判断免疫复合物的存在及含量。

试剂与仪器 有成套试剂盒出售。

实验步骤

按试剂盒说明书进行,主要步骤如下:

(1)将待检血清和参考血清(HAHG)分别加入0.2mol/L EDTA溶液中,37℃30min,使体内已和免疫复合物结合的C1q被灭活除去;

(2)每孔加100ul上述灭活的待检血清或参考血清,37℃2h,TBS液 洗三遍;

(3)每孔加1:2000 HRP-抗人IgG 100ul,室温作用1h,TBS液 洗三遍;

(4)每孔加底物100ul,放置暗处10-30min,直至显色;

(5)每孔加50ul 2mol/L H2(SO4)2 终止反应,测A492nm值;

(6)以参考血清HAHG作标准曲线,求出待检血清中免疫复合物的含量。

注意事项

(1)采用C1q固相法测定免疫复合物,由于包被用的C1q非常不稳定,所以测定的结果稳定性较差;

(2)SLE患者血清中抗C1q抗体能产生假阳性;

(3)尽可能采用新鲜血清标本,或-20℃保存,避免反复冻融。

参考文献

(1)陶义训. 1997.免疫学和免疫学检验.北京:人民卫生出版社,211-219;

(2)杨廷彬,尹学念.1994.实用免疫学.长春:长春出版社,548-552。
3、固相抗C3 ELISA法测定免疫复合物

简要原理 免疫复合物在激活固定补体的过程中会产生灭活的C3b(iC3b),而结合在免疫复合物上的i C3b可以与抗C3抗体结合。利用酶标记的抗免疫球蛋白抗体可以检测免疫复合物的含量。

试剂与仪器 有成套试剂盒出售。

实验步骤

按说明书进行,主要步骤如下:

(1)用含0.01M EDTA的pH7.5的PBS稀释待检血清;

(2)每孔加入100ul的稀释待检血清,设置三个复孔;

(3)用胶带覆盖酶标板,37℃温育30min,然后4℃放置1h,用BBS–吐温洗涤三次;

(4)每孔加入200 ul HRP-抗人IgG;

(5)用胶带覆盖酶标板,37℃温育30min,然后4℃放置30min;

(6)用BBS–吐温洗涤三次。用蒸馏水冲洗两次;

(7)每孔加入200ul底物液,放置暗处10-30min,直至显色;

(8)每孔加入50ul 4M H2(SO4)2终止反应,用酶标仪测A490nm值。

注意事项

(1)试验时需要以正常人血清设置阴性对照;

(2)本试验方法敏感,可达5-10ug/ml;

(3)本试验方法可以检测能够固定补体的免疫复合物(主要是IgM与抗原组成的免疫复合物或IgG1-3与抗原组成的免疫复合物);

(4)不适当的操作可以造成IgG的非特异性凝集,如血清反复冻融、加热灭活,或不恰当的贮存,均可造成假阳性。

参考文献

Pereira,A.B.,Theofilopoulos,A.N. and Dixon,F.J.1980. Detection and partial characterization of circulating immune complexes with solid-phase anti-C3.J.Immunol.125:763-770.

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