【操作步骤】
1．加样品：将标本稀释液100ul（或2滴）加到包被板内（预留阴阳性及空白对照2－5孔），将待检血清用PBS或生理盐水按1：20稀释后取 10ul加入反应孔内。
2．加对照：加入阴性对照1－3孔，阳性对照1孔，各100ul对照血清。空白对照1孔空置。
3．温育：将反应板震荡使样品混匀后，置37℃温箱或水浴反应20分钟。
4．洗板：用蒸馏水将浓缩洗涤液15ml稀释至300ml。
（1）手洗：将反应板孔内容物倾出，将洗涤液注满反应孔，放置30秒钟后用力甩去，如此重复5次后拍干。
（2）机洗：5次，每孔注入洗涤液200ul或注满，停留30秒钟后吸尽拍干。
5．加酶标工作液：每孔加入100ul（或2滴）酶标工作液，置37℃温箱反应20分钟后，洗板5次，洗板操作同步骤4。
6．显色和终止反应：将底物A、B液各50ul（或1滴）加到反应孔内，37℃避光显色10分钟。每孔加入终止液50ul（或1滴）混匀终止反应。
【结果判定】
1．酶标仪设定波长450nm，先用空白调零，然后测定各孔OD值；如果选用双波长测定，不必设置空白对照孔。
2．当阴性对照平均OD值小于0.08，阳性对照（pc）OD值大于0。30时，说明试剂盒有效且实验操作正确，否则应当重复试验。
3．临界值（CUT—OFF VALUE）＝0.15＋阴性对照平均（NC）OD值（当阴性平均OD值小于0.05时，按0.05计算；当阴性平均OD值大于或等于等于0.05时按实际值计算）。
4．标本OD值≤临界值为阴性，标本OD值>临界值为阳性。
常用不同培养板的孔底面积及推荐加液量：不同孔板所加培养液的液面都不宜太深，一般在2-3mm范围，结合不同孔的底面积就可算出各培养孔的适宜加液量。若加液量过多会影响气体（氧气）交换，而且在搬动过程中易溢出造成污染。具体所加细胞密度依实验的目的不同灵活掌握。
培养器皿 面积（cm2）培养液量（ml） 细胞量
96 孔培养板 0.32 0.1 10e5
24孔培养板 2 1.0 5×10e5
12孔培养板 4.5 2.0 10e6
6孔培养板 9.6 2.5 2.5×10e6
3.5 cm 培养皿 8 3.0 2×10e6
6 cm 培养皿 21 5.0 5.2×10e6
10 cm 培养皿 55 10.0 13.7×10e6
25cm2 培养瓶25 5.0 5×10e6
75cm2 培养瓶75 15～30 2×10e7
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