一、实验内容
1、细胞电子显微镜检测
2、细胞活率测定
3、亚细胞结构的分离与鉴定
二、实验设计
前一天细胞传代:
1. (电镜)中午每班传细胞入含小盖片培养瓶3瓶
晚上1瓶正常、2瓶损伤
次日损伤2瓶中,其中1瓶损伤恢复
2. (活率)中午每组传细胞入96孔培养板9孔
晚上3孔正常、6孔损伤加无糖培养液
次日损伤6孔中,其中3孔损伤恢复
3. (分离)每组传代细胞(1传2)25ml培养瓶2瓶
三、操作
(一)电镜标本制备、送检、观察比对正常、损伤及损伤后恢复标本、照相、分析、总结
(二)细胞活率测定――MTT比色法
实验步骤:
1、接种1.5×104/ml细胞于96孔板、每孔加200ul培养液 37℃、5%CO2、饱和湿度下培养;
2、测定前2h,每孔吸弃原培养液,加高糖培养液180ul 、再加 MTT溶液20ul,继续培养;
3、到2h测定时,每孔吸弃培养液,加DMSO溶液150ul,振荡1分钟;
4、酶标仪492nm波长处比色。
结果观察及要求:
1、活细胞被染成深蓝色,而死细胞不被染色
2、记录酶标仪上光吸收值,记录结果
3、分析每组细胞生长情况
注意事项:
1、吸弃和添加培养液时要注意,尽量不要将细胞吹起;
2、每孔的细胞密度不能超出1x105 /ml ,避免影响实验的区分度;
3、高浓度血清会导致实验本底增高,比色前尽量使血清浓度不超过10%。
(三)亚细胞结构的分离与鉴定(细胞核的提取)
操作:
收集细胞(消化法)—— 离心(1000/min×5’ ) ——沉淀加0.075M KCl
4ml,吹打,静置20min——离心(1500/min×10’ ) —— 取沉淀加蔗糖溶液4ml,打匀——离心(2500/min×10’)
——取沉淀加少量固定液涂片——酒精灯烤干——甲醇固定5 ’——Giemsa染色5
’——自来水冲洗——吸水纸吸干玻片(反面)——显微镜下观察(鉴定)
结果:
细胞核染成深兰色
注意事项
1、注意正确使用离心机(平衡、对称)
2、正确使用显微镜
3、Gimsa工作液临用前稀释
(PBS:Gimsa原液9:1)