实验概要
Western印迹法检测蛋白的敏感性约为1-5ng,0.75mm厚的SDS-PAGE板的一个孔可上总蛋白量约为100μg,所以只要被检蛋白不低于总蛋白量的万分之一,即可被检测出来。如果所分析的样品为未知时,应同时作阳性对照。杂交技术主要有NC膜的封闭,靶蛋白与第一抗体的反应,结合靶蛋白的一抗与二抗的反应,显色等几部分构成。
实验原理
该技术的原理及过程主要为转移到NC等膜上的蛋白带。用其它蛋白作为封闭液,将膜上余下的其它蛋白可结合点封闭。加入与待检测目标靶蛋白有特异性的第一抗体,经免疫反应,一抗将与目标蛋白结合,再经用洗膜液洗涤后,膜上仅在靶蛋白上结合有第一抗体。再加入与第一抗体有免疫特异性的二抗,使之与一抗反应,反应后,经洗膜液洗涤,二抗就仅存在于结合靶蛋白的一抗上。因为这种二抗都为酶标抗体,所以通过酶标反应,在显色液中,膜上结合靶蛋白-一抗-二抗的位置即将呈现一定的颜色。
主要试剂
封闭液(TBST,3%BSA)
漂洗液 TBST(10mMTris-HCL,pH8.0,0.15mMNaCL,0.05%Tween-20),PBS(0.8%NaCl,0.02%KCl,0.144%Na2HPO4 0.024%KH2PO4 pH至7.4)
辣根过氧化物酶显色液(可用Ⅰ或II)
Ⅰ 取6mg diaminobenzidine tetrahydrochloride 溶于9ml 100mM Tris-HCl(pH7.6)中,加入1ml 0.3%(w/v)的NiCl2或CoCl2。过虑去除沉淀。取10ul 30%双氧水与上液充分混匀
注意,此液必须新鲜配制。
II 取20mg,4-chlor-1-raphthol于20ml冷甲醇中,另取60μl30%双氧水,混匀。
注意,此液必须新鲜配制。
碱性磷酸酶显色液
5%NBT溶液 (溶于70%二甲基甲酰胺中) 66ul
5%BCIP溶液(溶于100%二甲基甲酰胺中) 33ul
碱性磷酸酶缓冲液 100mMNaCl 5mMMgCl2 100mMTris-HCl(pH 9.5)
以上三者充分混匀,需要在30分钟内使用完。
主要设备
塑料封口机 摇床
实验步骤
1. NC膜漂洗,NC膜用TBST缓冲液漂洗一次
2. NC膜的封闭
NC膜与蛋白质的结合无任何特异性,因此作为特异性检测靶蛋白的探针-一抗蛋白也能与NC膜结合,而一旦这种结合情况发生,当加入二抗后,背景上将出现许多非特异性条带,而则势必造成目标蛋白的不可检测性。因此Western印迹技术的敏感性、可行性将取决于能否对NC膜上一些蛋白质潜在结合位点进行有效封闭。在实际操作中这些结合位点一般用脱脂奶粉封闭,也可用血清白蛋白封闭。如果操作中加蛋白封闭后,非特异性背景仍很大的话,则可在封闭液中加入Tween20,Tween20的存在,能降低背景噪声,且不影响抗体与靶抗原的结合。
将A中经电转移并干燥的NC膜放于一平皿中,加入封闭液(液面需盖过胶面)室温下轻轻遥荡2-3小时。
2. 目标靶蛋白与第一抗体的反应
一抗的稀释:将第一抗体用封闭液稀释,稀释度由预实验确定,但可参考下列数据:多克隆抗体,1:100-1:5000 培养的杂交瘤细胞上清液,1:100 鼠腹水细胞1:1000-1:10000
3. 将B中封闭好的NC膜,放入塑料袋中,加入一抗,加入量为0.1ml一抗/cm2
NC膜,赶尽塑料袋内所有气泡,封口机封口,4℃下轻轻震荡2小时。
注意,在室温下,延长反应时间,可增加靶蛋白的可检出量,但也会增加非特异性结合,加大背景噪声。
4. 洗膜。反应完毕后,将塑料袋剪开,弃去反应液,用PBS洗三次,每次10分钟。
5. 靶蛋白-一抗复合物与二抗反应
1) 将膜从PBS溶液中转至TBST溶液中,室温下轻轻震荡10分钟。
此操作是为了去除NC膜上的磷酸及叠氮钠
2) 将二抗用二抗稀释液稀释,稀释度一般为1:200-1:2000。
3) 将膜放入一塑料袋中,加入二抗溶液,加入量一般为0,1ml二抗溶液/cm2膜,封好塑料袋,在室温下轻轻震荡1小时。
6. 剪开塑料袋,取出NC膜,在TBST溶液中冲洗1-5次,每次10分钟。
7. 显色
1) AP系统
a. 将膜放入碱性磷酸酶显色液(10ml碱性磷酸酶缓冲液,66ulNBT,33ulBCIP)中,室温下轻轻摇动。
b. 待条带出现后(约显色20分钟),将膜放入200ul0.5MEDTA(pH8.0)和50mlPBS溶液中
c. 照相
2) 辣根过氧化物酶系统
a. 将膜放入显色液中,室温下轻轻摇动。
b. 待条带出现后(约显色1-3分钟),立刻用水洗膜,然后转入PBS中
注意,此显色带在阳光下几小时即褪色
c. 照相