定量RT-PCR(Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)
获得基因序列后,可以在极短的时间内,设计特异性引物,通过qRT-PCR进行检测。通常,也是临床上最早可以获得的,进行大规模人群筛查的方法。
qRT-PCR特点
方法灵敏度足够高,可以达到10拷贝/ml 以下(文献1),
时间约2-4小时
疫情早期诊断主要方法(抗原抗体的开发需要时间)
假阴性(CT影像诊断阳性,核酸阴性)可能原因:突变引起的引物脱靶;鼻咽拭子取样问题;样本运输问题等
环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)
LAMP作为POCT式的核酸检测设备,在传染病爆发期,可以大大增加检测可及性(尤其是在技术欠发达地区,交通枢纽,机场等),以及检测及时性。
RT-LAMP的检测灵敏度可以达到10拷贝
60-65℃等温扩增
时间约15-40分钟
仪器价格较qRT-PCR低
CRISPR-Cas RNA鉴定系统
CRISPR-Cas系统是鉴定平台,主要用于鉴定RT-PCR或者RT-LAMP的扩增产物。具体原理和过程见下图。
CRISPR-Cas联合RT-LAMP技术,可以实现LoD:10拷贝/μL ,(90% 灵敏度100% 准确度)
图片来源于文献3
免疫学检测
获取基因序列之后,大量的上游原料厂商开始表达抗原,研发抗体。随即抗原和抗体检测试剂快速开发。主要的检测方法有ELISA法,胶体金法,化学发光法,免疫荧光法等。其中胶体金法,作为POCT的方法,使用最为广泛。
抗原检测(胶体金法)
国内有多个产品上市,例如:
东方基因(Healgen)新型冠状病毒快速检测试纸(胶体金免疫层析法);
万孚生物(wondfo)2019-nCoV新型冠状病毒抗原检测试剂(免疫层析法);
重庆业为基COVID-19新型冠状病毒抗原检测试剂盒(胶体金法)
特点:
快速:全程10-15分钟
早期:和核酸一致
便利:无需仪器配套
灵敏度:5-10 TCID50/test
缺点:灵敏度不如核酸qRT-PCR法
用途:呼吸道病毒鉴别诊断
抗体检测(胶体金法)
用于回顾性检测,流行病学调查。
因为免疫流程,感染初期并不出现抗体,因而不适合疾病的早期筛查。一般适用于疾病的回顾性检测,流行病学调查。另外,因为疾病消退后,抗原和核酸消失,但是抗体IgM和IgG半衰期长,因而回顾性研究,可以使用抗体血清学检测。
新冠IgM/IgG抗体检测试剂盒,有更多的厂家(万孚,丽珠试剂等)提供,不做赘述。
细胞因子风暴检测
细胞因子风暴是新冠肺炎病情危重的重要因素,因而在新冠肺炎诊疗方案中建议:有条件者可行细胞因子检测。
细胞因子风暴检测组合包含:IL-1β,IL-17A,IL-2,IL-4,IL-6,IL-8,IL-10,TNF-α,IFN-γ,MCP-1,IP-10,GM-CSF等。
细胞因子本是Roche,西门子等体外诊断巨头已有检测项目,但多年来并不受关注,甚至没有相关组合试剂提供,尤其是可以检测所有项目的组合试剂。
在本次新冠期间,经典的多因子检测品牌Luminex和基于流式细胞术的多因子检测在临床上占据了主导位置。
未来,传统巨头是否会增强其细胞因子检测平台,尤其是试剂提供吗?毕竟,除了新冠,甲流等;CAR-T治疗,免疫检查点治疗副作用检测,细胞因子风暴也是非常重要的项目,是有一定市场体量的。
未来技术展望
新冠防控的薄弱点是人群聚集的公共区域,如菜市场,商城,交通工具等。如何对公共区域进行检测,是一个难点,国内清华伯克利深圳研究院,南方科技大学,联合罗切斯特理工学院的科学家,在ACS infection disease上的文章,给了很多开创性的思路,如下图,供大家参考。
喵评:上述方法,其实大家早已熟知。梳理一遍,主要帮大家了解不同技术的使用和开发背景。如果,有科学家能够开发出公共区域病毒采集检测预警系统,将会极大帮助现在和未来新发传染病的公共预防控制。
参考文献
Chan, J. F.-W.,, et al. (2020) Improved Molecular Diagnosis of COVID-19 by the Novel, Highly Sensitive and Specific COVID-19-RdRp/Hel Real-Time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay Validated in Vitro and with Clinical Specimens. J. Clin. Microbiol. 58,e00310-20.
Robin Augustine, et al, Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP): A Rapid, Sensitive, Specific, and Cost-Effective Point-of-Care Test for Coronaviruses in the Context of COVID-19 Pandemic, Biology 2020, 9, 182
MEAGAN N. ESBIN et al, Overcoming the bottleneck to widespread testing: a rapid review of nucleic acid testing approaches for COVID-19 detection,RNA (2020) 26:771–783
D'Cruz RJ, Currier AW, Sampson VB,Laboratory Testing Methods for Novel Severe Acute Respiratory Syndrome-Coronavirus-2 (SARS-CoV-2),Front Cell Dev Biol . 2020 Jun 4;8:468
Xi Yuan, Chengming Yang, Qian He, Junhu Chen, Dongmei Yu, Jie Li, Shiyao Zhai, Zhifeng Qin, Ke Du,Zhenhai Chu,and Peiwu Qin,Current and Perspective Diagnostic Techniques for COVID-19,ACS Infect. Dis. 2020, 6, 1998−2016