研究点突变疾病的利器——点突变模式动物
依靠同源重组，可以将含有突变碱基的DNA片段整合到基因组中，但过低的重组效率以及种属局限限制了点突变的研究。随着各种核酸酶技术在2009-2013年之间井喷式的发展及以后的不断完善，尤其是Crispr/Cas9技术的发明，使得基因编辑的效率大幅提高，难度和成本也显著降低，其在点突变疾病研究中发挥着重要作用。
在目前的临床前研究中，传统转基因和基因敲除动物仍然占有相当比重。但是，人类疾病中基因产物并非总是如转基因一样的高表达，也不是像基因敲除动物一样完全不表达。很多情况下只是由于单个或者少数几个碱基的改变而造成的蛋白结构改变，表现为非正常激活或者抑制。因此，构建精细的与疾病对应的点突变动物模型便成为了疾病临床前研究的最佳方案。而现在的Crispr/Cas9技术也使得我们能够以更低的成本和功能高的效率将之实现。赛业生物红鼠库通过对上千例Crispr项目进行深度学习，综合gRNA切割位点、点突变位置、oligo长度、同义突变个数、所在位点Cas9切割效率以及脱靶率等因素，智能化生成gRNA设计方案。
此外针对通常条件下，细胞偏向于使用非同源末端连接的方式对断裂的双链进行修复，进而造成靶位点基因的插入/缺失突变。赛业生物团队在 Crispr/Cas9 技术的基础上创新性研发出 CRISPR-Pro 基因修饰技术，采用独特的受精卵处理方式让受精卵偏好同源重组修复路径，进而提高同源重组效率。
图5. 赛业助您构建点突变模式动物。
模式动物的基因与人类往往存在几个碱基的差异，比如目前主流观点中造成AD的元凶Aβ序列，小鼠与人类之间存在3个碱基的差异，而家族性AD中除了需要人源化Aβ以外，还需要将Aβ前体APP的致病碱基进行突变。此外，针对两个距离接近的突变位点和距离远的突变位点，也需要采用不同的打靶策略。赛业生物就不同的距离点突变动物的构建已经形成了一套成熟的体系，以最少的步骤构建出您所需要的动物，节省宝贵的研发时间。
图6. 点突变小鼠数据库及定制平台。
赛业点突变模型成功案例节选
使用赛业点突变数据库可以高效智能地设计双gRNA切割。以阿尔茨海默病致病基因APP为例，可以通过赛业的点突变小鼠数据库获取该基因编码蛋白的不同类型，根据氨基酸位点设计点突变方案，经过深度学习的系统会根据gRNA切割位点。按照图中步骤设置即可完成设计。
图7. 点突变设计。
基于我们的研究目的，我们将APP基因进行Aβ片段的人源化改造（改造三个位点），并引入文献中报道能抑制Aβ产生的A673T突变，用以在动物模型中研究这个位点突变的功能。
图8. 点突变设计。
基于上述系统，赛业已成功开发多种多点突变动物，尤其是我们以大鼠为对象构建的阿尔茨海默病相关模型，其文献已经发表。
图9. 赛业生物已完成多位点突变项目及发表文献。
作为基因改变相关疾病最主要的诱因，针对点突变的研究不论是在先天的遗传疾病还是后天突变导致的肿瘤中都具有重要的意义。要在动物身上研究人类疾病，除了致病突变以外，对蛋白关键位点的人源化也是药物评价中不可或缺的，因此高效的多点突变模式动物会有更多的应用场景，我们也将不断探索，更快更好地为客户您提供优质的点突变模型。
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