应用LAL动态浊度法测定复方苦参注射液中细菌内毒素含量

王信１，冯宇２*，范祥元３，杨喆２，高蕾２（１. 国家食品药品监督管理总局高级研修院，北京 100073；２. 科德角国际生物医学科技（北京）有限公司，北京 100068；３. 安徽省食品药品检验研究院，合肥 230051）

摘要 目的：建立应用美洲鲎试剂LAL的动态浊度法定量检测复方苦参注射液中细菌内毒素试验方法。
方法：采用《中国药典》2015年版（四部）中的细菌内毒素检查法。结果：复方苦参注射液用细菌内毒素定量法检测无干扰因素影响，内毒素回收率在50%~200%范围内。结论：使用LAL进行动态浊度法定量检测复方苦参注射液的细菌内毒素是可行的，可用细菌内毒素方法代替兔热原检查法，同时又避免了限量法内毒素检测时的干扰。
关键词：复方苦参注射液；细菌内毒素；动态浊度法；干扰试验；美洲鲎试剂

Application of the Turbidimetric-Kinetic Method Using LAL for the Measure-ment of Endotoxin in Composite Radix Radix Sophora Flavescentis Injection

WangXin¹，FengYu^2*，FanXiangyuan3，YangZhe2，GaoLei² (1. China Food and Drug Administration Institute of Executive Development, Being 100073; 2. Coastal-Times International BioMedical Technologies (Bei-jing)  Co. , Ltd. , Beijing 100068 ; 3. Ahhui Institutes For Food and Drug Control, Hefei 230051)

Abstract Objective: To develop an assay for determination of bacterial endotoxin (BET) using LAL in Composite Radix Sophora Flavescentis Injection. Methods: BET was determinated by turbidimetric-kinetic method. Results: The contentin Composite Radix Sophora Flavescentis Injection did not interfere with the quantitation of BET. The recovery of BET was between 50%  and 200%. Conclusion: The method using LAL is proved to be suitable for determination of the BET in Composite Radix Sophora Flavescent is Injection and could be used as an alternative
for the rabbit pyrogen test to the injection.
Keywords: Composite Radix Sophora Flavescentis Injection; Bacterial endotoxin; Turbidimetric-Kinetic method; Interfere factors test; LAL
 

复方苦参注射液又名岩舒注射液 (compound Kusheninjection, CKI)，是由苦参、白土苓两味药经

提取加工精制而成的纯中药制剂，收载于卫生部药品标准^[1]，具有清热利湿、凉血解毒、散结止痛之功

效。现代研究表明其具有抗肿瘤、抗炎、镇痛、提高机体免疫力等多种药理作用，临床上广泛用于非小

细胞肺癌、原发性肝癌、消化道癌及恶性胸腔积水等重症疾病的辅助治疗^[3-8]。目前我国药品标准对复方苦参注射液采用家兔法进行热原检查。但家兔热原检查操作复杂，影响因素多，而细菌内毒素限量检查又具有较大的干扰性^[9]，故选用动态浊度法测定其细菌内毒素以消除其干扰，结果准确可靠。而目前对复方苦参注射液的检测研究多基于东方鲎试剂TAL，基于美洲鲎试剂LAL的检测鲜有报道，本文主要应用 LAL对复方苦参注射液进行动态浊度法检测，同时所采用的仪器耗材均为美国 ACC产品，结果准确可靠，符合美国FAD相关标准，从而为复方苦参注射液的美国 FAD认证申报提供参考。

1 材料与仪器
复方苦参注射液(山西振东制药股份有限公司)；LAL试剂(批号 516-06-789-T，λ=0.001EU·mL^-1，规格 5mL/瓶，美国 ACC公司)；细菌内毒素工作标准品(批号 154,美国 ACC公司);细菌内毒素检查用水(批号 AB215748，规格 50mL/瓶，美国ACC公司)；PKF96细菌内毒素检测仪(美国 ACC公司)｡

2 方法与结果
2.1 细菌内毒素限值的确定^[1]
公式为：L=K·M^-1，K为规定的给药途径，即人每公斤体重每 1h最大可接受的内毒素剂量，注射
剂为 5.0 EU·kg^-1；本品的日静脉注射量为 12mL，加入 0.9% 氯化钠注射液 200mL中静滴，静注时间
按 1h计。中国人均体重按 60kg 计算，则 M为 1h每公斤体重人的最大给药剂量为 0.2mL·kg^-1，计
算得样品的内毒素限值 L为 25 EU·mL^-1｡

2.2 标准曲线制备及可靠性^[2]
用细菌内毒素检查用水 LRW 将内毒素工作标准品进行 5倍稀释，最终细菌内毒素浓度分别为
0.625､0.125､0.025､0.005､0.001EU·mL^-1稀释系列；各取 0.1mL样本分别加到反应管内，后加入
0.1mL LAL 试剂并涡旋 1-2秒混合均匀,立即插入PKF96细菌内毒素检测仪内进行自动检测，其中每
一个浓度重复 3管｡  仪器自动绘制标准曲线,结果见图 1。回归方程：LgT=2.667-0.3029LgC其中相关系数 r=-0.994；最低浓度 λ=0.001EU·mL^-1；空白对照管在检测时间外,故标准曲线成立｡

图 1 标准回归曲线
Fig.1 Standard Curve

2.3 干扰试验
2.3.1 样品稀释倍数计算^[3]
公式为:MVD=L·C·λ^-1｡L为复方苦参注射液内毒素限值；C为1.0mL·mL^-1；λ为标准曲线的最低内毒素浓度0.001EU·mL^-1；计算得复方苦参注射液最大有效稀释倍数 MVD为 25000倍(由于美国 ACC鲎试剂的灵敏度较高，λ值较低，故可稀释倍数更大)｡

2.3.2 样品溶液配制及干扰试验
将复方苦参注射液用内毒素检查用水 LRW 依次稀释为 200,400,500倍溶液，记为 A溶液；同时另取 3管，进行 100,200,250倍数稀释，但在稀释液中添加等体积浓度为 0.05 EU·mL^-1的细菌内毒素工作标准品溶液；作为样品添加内毒素阳性对照管，记为 B溶液(经此步操作保证 B溶液最终样本稀释倍数仍为 200､400､500倍,内毒素工作标准品终浓度均为 0.025EU·mL^-1)；分别取上述各液 0.1mL，加入预先加
有 0.1mL LAL 试剂的反应管内, 涡旋 1-2s混匀立即插入 PKF96细菌内毒素检测仪内进行检测，其中每一个浓度重复 3管，仪器软件会自动计算回收率｡
回收率 (%)=(B液内毒素值-A液内毒素值)/0.025×100%｡ 结果见表 1｡
标准曲线：LgT=2.667-0.3029 LgC  r=-0.994｡

样品的添加内毒素平均回收率均在 50% ~200%范围内，符合中国药典 2015年版第四部及美国药典 85 of USP 39 规定，表明样品的 3个浓度溶液对鲎试剂 LAL均无干扰影响｡

2.4 样品溶液定量试验
分别取 4 批复方苦参注射液,用内毒素检查用水 LRW 依次稀释为 200 倍溶液，记为 A溶液；同时另取 3管，进行 100倍数稀释，但在稀释液中添加等体积浓度为 0.05 EU·mL^-1的细菌内毒素工作标准品溶液;作为样品添加内毒素阳性对照管，记为 B溶液(经此步操作保证 B溶液最终样本稀释倍数仍为 200倍，内毒素工作标准品终浓度均为 0.025 EU·mL^-1)；其中每个浓度重复 3管，计算回收率，结果见表 2。4批复方苦参注射液的回收率均在50% ~200%范围内，表明复方苦参注射液在本试验条件下对 LAL 无干扰，因此日常检验选用 200倍稀释液即可。结论：4批次复方苦参注射液内毒素含量均符合规定｡

3 讨论
3.1 干扰实验符合药典规定
从复方苦参注射液的干扰试验结果发现：复方苦参注射液用美洲鲎试剂 LAL进行细菌内毒素动态浊度法检测，由于内毒素回收率在50%~200%范围内，表明不存在干扰因素影响，且 ４批复方苦参注射液（未超过 MVD的四个稀释梯度）的内毒素含量均在规定限度25 EU· mL^-1 以下。
 

表1 复方苦参注射液干扰实验结果
Tab 1  Radix Sophora Flavescentis Injection interference test result

表 2 复方苦参注射液定量试验
Tab.2  Radix Sophora Flavescentis Injection quantitive test

３.２ 动态浊度法可代替传统家兔法
用传统的家兔法检测细菌内毒素，由于操作复杂，影响因素多，对试验结果影响很大。利用美洲鲎试剂 LAL动态浊度法进行细菌内毒素定量检测，具有操作简便，结果准确，检测灵敏度高等优点，尤其避免了由于家兔差异及人为主观判断所出现的假阳性或假阴性结果。经过动态浊度法试验，样品的细菌内毒素定量检测各项结果均符合中国药典 2015(四部)及美国药典 85 of USP 39要求，说明使用美洲鲎试剂LAL 进行细菌内毒素动态浊度法测定复方苦参注射液的细菌内毒素是可行的，可代替传统家兔热原检查法。

３.３ 实验结果可追踪充分保证数据完整性

实验中所有实验数据均可进行审计追踪，美国 ACC内毒素检测仪配套软件Pyros EQSv1.2经美国FDA认证，配备有oracle数据库，能够提供强大的审计追踪功能，充分保证数据完整性及安全性。便于今后复方苦参注射液美国 FDA的认证申报。

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