在qPCR 技术中重要的参数指标有哪些?
扩增及溶解曲线:扩增曲线是PCR过程中,以循环数为横坐标,以荧光强度为纵坐标所绘制的曲线。主要用于反映qPCR的动态进程;溶解曲线是用来验证扩增产物特异性的,如果产物是单一条带,溶解曲线就会出现单峰,如果有引物二聚体或其它非特异性扩增,就会出现至少两个峰。
荧光域值(threshold): 是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值,它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上,但一般荧光域值的缺省设置是PCR反应前3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍,即:threshold。
Ct 值:是指每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数。将已知浓度的标准品梯度稀释进行qPCR,按照起始DNA量由多到少的顺序等间隔得到一系列扩增曲线。Ct值与起始模板数的对数值之间存在线性关系,可以制作标准曲线。未知浓度的样品也得到Ct值,代入标准曲线,就可以求出未知样品的起始模板量。
扩增曲线一般分为哪几个阶段
荧光扩增曲线一般分为基线期、指数增长期和平台期。在qPCR扩增早期,扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖,无法判断产物量的变化,此时即为基线期,
PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数形式增加的,随着反应循环数的增加,最终PCR反应不再以指数形式生成模板,从而进入平台期,在该时期,扩增产物已不再呈指数级的增加,PCR的终产物量与起始模板量之间无线性关系,只有在荧光信号的指数增长期,PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系,可以选择在这个阶段进行定量分析。
ROX染料是什么作用?
ROX(Passive Reference Dye)是一种惰性参比染料,在qPCR反应中能被qPCR仪检测到。ROX不参与qPCR反应,荧光信号值不会随着qPCR扩增而改变。实验过程中很多因素会引起孔间差异:不均匀的照明,孔与孔之间光学因素(液滴、气泡)的因素,反应体系的浓度不同…… 可以用ROX作为阳性参比,对其他荧光信号进行归一化校正,以提高数据的精确度。
Ct值多少才算理想
一般来说Ct值在30以下都可以说实验结果是可靠的,30以上基本可以说明该基因没有扩增,但也不是绝对的,需要辅以溶解曲线加以解释。
*** qPCR 常见问题分析 ***
问题类型 | 原因分析 |
无Ct值出现 | * 检测荧光信号的步骤有误:一般染料法采用72℃延伸时采集,探针法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号; * 引物或探针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性; * 模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起; * 模板降解:避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况 |
Ct 值出现过晚(Ct>38) | * 扩增效率低:反应条件不够优化,设计更好的引物或探针、适当降低退火温度、增加镁离子浓度等; * PCR各种反应成分的降解或加样量不足; * PCR产物太长:一般采用80-150bp的产物长度 |
标准曲线线性关系不佳 | * 加样存在误差:使得标准品不呈梯度; * 标准品出现降解:应避免标准品反复冻融,或重新制备并稀释标准品 * 引物或探针不佳:重新设计更好的引物和探针; * 模板中存在抑制物,或模板浓度过高 |
扩增曲线异常,比如 S 型曲线 | * 参比染料设定不正确:预混液不加参比染料时,选NONE; * 模板的浓度太高或者降解; * 荧光染料的降解 |
负对照有信号、溶解曲线不止一个主峰 | * 引物设计不够优化:应避免引物二聚体和发夹结构的出现 * 引物浓度不佳:适当降低引物的浓度,并注意上下游引物的浓度配比 * 镁离子浓度过高:适当降低镁离子浓度,或选择更合适的mix 试剂盒; |
扩增效率低 | * 反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解; * 反应条件不够优化:可适当降低退火温度; * 反应体系中有PCR反应抑制物:一般是加入模板时所引入,应先把模板适度稀释,再加入反应体系中,减少抑制物的影响 |