引言 众所周知,新冠病毒是会引起肺部损伤的。为助力您探究其感染机制,PeproTech在此为您提供一份全面的人肺脏类器官培养方案。 肺类器官由ESCs/iPSC分化而来,hESCs体外肺分化实际上是通过加入多种细胞因子和小分子化合物模拟体内肺发育各阶段的过程,hESCs体外肺分化主要经历以下几个阶段:
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▶▶ 实验材料◀◀ |
1. Matrigel人胚胎干细胞培养用基质胶,于冰上分装后保存于-80℃。(Corning,Cat#354277) 2.Advanced DMEM/F12培养基。(Thermo, Cat#12634010) 3. Matrigel类器官培养用基质胶,于冰上分装后保存于-80℃(Corning,Cat#356231) 4.Knock Out Serum Replacement, 分装后保存于-20℃。(Thermo,Cat#A3181502) 5.B-27 trademark Supplement(50X), 分装后保存于-20℃(Thermo,Cat#17504044) 6.N-2 Supplement(100X),分装后保存于-20℃。(Thermo,Cat#17502001) 7.HyClone-defined FBS ,分装后保存于-20℃。(Thermo Fisher Scientific,Cat#10437010) 8.mTeSR™1(Stemcell Technologies, Cat#85850) 9.Activin A配制为100μg/ml, 保存于-80℃,使用终浓度为100ng/ml。(PeproTech,Cat#120-14) 10.Noggin配制为200μg/ml,保存于-80℃,使用终浓度为200ng/ml。(PeproTech,Cat#120-10C) 11.FGF4配制为500μg/ml,保存于-80℃,使用终浓度为500ng/ml。(PeproTech,Cat#100-31) 12.FGF10配制为500μg/ml,保存于-80℃,使用终浓度为500ng/ml。(PeproTech,Cat#100-26) 13.Y-27632配制为10mM, 保存于-80℃,使用终浓度为10μM。(BioGems, Cat#1293823) 14.SB431542配制为10mM, 保存于-80℃,使用终浓度为10μM。(BioGems, Cat#3014193) 15.CHIR99021配制为2mM, 保存于-80℃,使用终浓度为2μM。(BioGems, Cat#2520691) 16.SAG配制为1mM, 保存于-80℃,使用终浓度为1μM。(BioGems, Cat#9128694) 17.Accutase消化液(Thermo,Cat#A1110501) |
▶▶ ESCs/iPSC培养传代步骤◀◀ |
01/ hESCs的复苏 |
▶▶ 肺类器官的培养分化◀◀ |
01/ 取对数生长的hESCs肺类器官分化,hESCs(生长至约90%汇合)用预热RPMI1640基础培养基轻柔洗2次,加入含100ng/ml的ActivinA和2μM的CHIR99021的定型内胚层(DE)阶段诱导培养基(诱导第二天培养基内需要添加0.2%FBS, 诱导第三、四天培养基内需要添加2%FBS),每天换液,共4天。 02/ 第4天,细胞用Advanced DMEM/F12培养基轻柔洗2次,在DMEM/F12培养基种加入1xB27, 1xN-2以及含200ng/ml的Noggin,500ng/ml的FGF4,2μM的CHIR99021,1μM的SAG和10μM的SB431542的前部前肠内胚层(AFE)阶段诱导培养基,每天换液,共5天。 03/ 第9天,待细胞分化成前肠球体后,细胞用Advanced DMEM/F12培养基轻柔洗2次,加入适量Accutase消化液消化3~5min,收集细胞,1000rmp/5min离心,弃上清,加入适量预冷Matrigel(Cat#356231),吹打混匀,注意不要产生气泡,加入50ul种于24孔板内,37℃培养箱放置约30min,待Matrigel固化后加入肺类器官培养基(含1%FBS的 Advanced DMEM/F12培养基,1xB27, 1xN-2,500ng/ml FGF10)同时需要补加10μM的Y-27632。过夜后更换新鲜的含肺类器官培养基。细胞每3~5天换液一次,每5~8天传代一次,传代时需要加入含10μM的Y-27632肺类器官培养基。大约培养50天肺类器官可以成熟。 |
表1:肺类器官诱导培养用培养基配制方法 |
肺类器官培养步骤 |
注:AdvancedDMEM/F12培养基中若含有HEPES和L-glutamine,则不需要额外添加。 |
▶▶ 诱导培养用细胞因子和小分子◀◀ |