9.2培养
用灭菌镶子夹取滤膜移放在MFC培养基(6.1)上,滤膜截留细菌面向上,滤膜应与培 养基完全贴紧,两者间不得留有气泡,然后将培养皿倒置,放入恒温培养箱内,44.5°C ±0.5°C 培养 24h±2h。
9.3对照试验
3. 1空白对照
每次试验都要用无菌水(6.3)按照步骤9.1和9.2进行实验室空白测定。
9. 3. 2阳性及阴性对照
将粪大肠菌群的阳性菌株(如大肠埃希氏菌Escherichia coli)和阴性菌株(如产气肠杆 菌Enterobacter aerogenes)制成浓度为40~600 CFU/L的菌悬液,分别按照9.1~9.2步骤培养, 阳性菌株应呈现阳性反应,阴性菌株应呈现阴性反应,否则,该次样品测定结果无效,应查 明原因后重新测定。
10结果计算与表示
10. 1结果判读
MFC培养基上呈蓝色或蓝绿色的菌落为粪大肠菌群菌落,予以计数。
MFC培养基上呈灰色、淡黄色或无色的菌落为非粪大肠菌群菌落,不予计数。 结果判读参考图片见图1。
无菌落生长
图1结果判读参考图片
10.2结果计算
样品中的粪大肠菌群数(CFU/L),按照公式(1)进行计算:
八 Ci*1000C =
式中:C——样品中粪大肠菌群数,CFU/L;
Ci——滤膜上生长的粪大肠菌群菌落总数,个;
1000——将过滤体积的单位由ml转换为L ;
/——样品接种量,ml;
注:若平行样结果都在20〜60 CFU/L范围内,最终结果取平均值以几何平均计算。
10.3结果表示
测定结果保留至整数位,最多保留两位有效数字,当测定结果N100CFU/L时,以科学 计数法表示。粪大肠菌群检验记录及报告格式参见附录A。
11精密度和准确度
11.1精密度
6个实验室对低浓度(地下水,浓度均值为2.0X102 CFU/L)、中浓度(地表水,浓度 均值为
1.6X105CFU/L)和髙浓度(生活污水,浓度均值为1.6X107 CFU/L)三个不同浓度 粪大肠菌群的实际
样品和有证标准样品(浓度为3670 MPN7L,可接受范围为330〜 7710MPN/L)进行了6次重复测定:
实验室内相对标准偏差范围分别为5.3%〜12%、0.81%〜 2.1%、0.51%〜4.2%和7.7%〜9.8%;实验室间相对标准偏差分别为6.8%、3.9%、4.0%和3.6%; 实验室间95%置信区间见表2 o
表2实验室间95%置信区间
低浓度(CFU/L) | 中浓度(CFU/L) | 高浓度(CFU7L) | 标准样品(CFU/L) | ||||
均值 | 95%置信区间 | 均值 | 95%置信区间 | 均值 | 95%置信区间 | 均值 | 95%置信区间 |
2.0 X102 | L4X102 〜 2.9 X102 |
1.6X105 | 9.8X104 〜 2.6X105 |
1.6X107 | 8.2 X"〜 3.0X107 |
6.1 X102 | 3.8X"〜 9.9X102 |
11.2准确度
6个实验室对含粪大肠菌群浓度为3670MPN7L (可接受范围为330-7710 MPN/L)的标 准样品进行了6次重复测定:相对误差范围为-19%〜-32%;相对误差最终值为:-23%±10%。
注:微生物检测数据为偏态分布,其测定结果全部经以10为底对数转换后进行计算。
12质量保证和质量控制
12. 1培养基检验
更换不同批次培养基时要进行阳性和阴性菌株检验,将粪大肠菌群测定的阳性菌株(如 大肠埃希氏菌Escherichia coli)和阴性菌株(如产气肠杆菌Enterobacter aerogenes)配成适 宜浓度,按样品过滤(9.1)的要求使滤膜上生长的菌落数为20〜60个,然后按培养(9.2)的要求进行操作,阳性菌株应生长为蓝色或蓝绿色菌落,阴性菌株应生长为灰色、淡黄色、 无色或无菌落生长。否则,该次样品测定结果无效,应查明原因后重新测定。
12.2对照试验
12.2. 1空白对照
每次试验都要用无菌水做实验室空白测定(9.3.1),培养后的培养基上不得有任何菌落 生长。否则,该次样品测定结果无效,应查明原因后重新测定。
12.2.2阳性及阴性对照
定期按照9.3.2进行阳性及阴性对照试验,阳性菌株应呈现阳性反应,阴性菌株应呈现 阴性反应,否则,该次样品测定结果无效,应查明原因后重新测定。
13废物处理
使用后的废物及器皿须经121°C髙压蒸汽灭菌30 min或使用液体消毒剂(自制或市售) 灭菌后,器皿方可清洗,废物作为一般废物处置。
14注意事项
当样品浑浊度较高时,应选用其他方法。
附录A
(资料性附录)
粪大肠菌群检验记录及报告格式
表A. 1粪大肠菌群测定检验记录
项目名称: | 检验日期: | 年 月 日 |
检验方法 | 方法依据 | |
灭菌锅型号 | 出厂编号 | |
培养箱型号 | 出厂编号 | |
培养基灭菌温度(°C) | 培养温度(°C) | |
样品编号: | ||
过滤体积 | ml | |
滤膜上生长的菌落总数 | 个 | |
稀释倍数(D) | 倍 | |
结果 | CFU/L |
检验者:校对:审核:
注:可根据实际工作需要自行设计表格,至少要包括上述信息。
表A. 2粪大肠菌群测定数据报告格式
样品来源 | |||
采/送样日期 | 分析日期 | ||
样品数量 | |||
样品状态 | |||
监测点位 | 样品编号 | 监测频次 | |
标准方法名称 | 标准方法编号 | ||
测定值: | 监测结果: | ||
备注 |
注:可根据实际工作需要自行设计表格,至少要包括上述信息。