革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤,具体操作方法是:
(1)制片。
取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。
要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色;涂片不宜过厚,以免脱色不完全造成假阳性;火焰固定不宜过热(以玻片不烫手为宜)。
(2)初染。
滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)染色1-2min,水洗。
(3)媒染。
用碘液冲去残水,并用碘液覆盖约1min,水洗。
(4)脱色。
用滤纸吸去玻片上的残水,将玻片倾斜,在白色背景下,用滴管流加95%的乙醇脱色,直至流出的乙醇无紫色时,立即水洗。
乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节:脱色不足,阴性菌被误染成阳性菌;脱色过度,阳性菌被误染成阴性菌。因而脱色时间一般为20-30s。
(5)复染。
用番红液复染约2min,水洗。
(6)镜检。
干燥后,用油镜观察。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌,被染成红色的为革兰氏阴性菌。