目的:用于 Northern 杂交、纯化 mRNA、RT-PCR 及 DDRT-PCR 等。
材料:植物油嫩组织器官或种子萌发的幼苗。
1、异硫氰酸胍法
(1)试剂
①异硫氰酸胍溶液:4mol/L 二异硫氰酸胍,25mmol/L 柠檬酸钠(pH7.0),0.5%十二烷基肌氨酸钠,0.1mol/L 巯基乙醇。
②2mol/L NaAc(pH4.0):用经 DEPC 处理过的水配制,高压灭菌。
③水饱和苯酚(pH3.5)。
(2)操作
①取两只50mL 离心管,各加入15mL 异硫氰酸胍溶液,于冰上预冷。
②取5g 新鲜的幼嫩植物组织放在研钵中加入液氮,迅速研磨成均匀的粉末。
③将粉末全部移入冰上预冷的离心管中,振荡离心管混合均匀,将离心管置冰上。
④加入2mol/L NaAc 1.5mL、水饱和酚15mL 和氯仿/异醇3mL,每加一种试剂都轻轻摇晃离心管混合均匀,最后将离心管盖紧,倒转几次混合均匀,冰浴15min。
⑤4℃条件下15000离心力离心30min,将上层水相转移至另一干净的离心管中,向管中加入等体积的异丙醇,混匀,置一20℃冰箱冷冻1h。
⑥4℃条件下13000离心力离心25min,小心去除上清液,沉淀溶于5mL 异硫氰酸胍溶液中(体积为第一次异硫氰酸胍溶液体积的1/3),再加入等体积的异丙醇,混匀后置20℃冰箱冷冻1h。
⑦4℃条件下13000离心力离心20min,沉淀用70%乙醇洗一遍,稍微晾干后,溶于适量体积(约500L)DEPC处理的水中。检测后分装,于-70℃低温条件下保存。
(3)说明
①提取时使用的所有玻璃器皿和离心管都要用0.5%的 DEPC 溶液处理,37℃保温12h 以上,然后高压灭菌,枪头也需高压灭菌。以下各方法均同。
②该方法操作简便,同时可做多个样品,无需长时间氯化铯梯度离心,因此近年来已被许多实验室采用。
2、苯酚法
(1)试剂
①研磨缓冲液:6%4-氨基水杨酸盐,1%三异丙基萘硫酸盐,6%苯酚,50mmol/L Tris·Cl(pH8.4)。
②4mol/L NaAc(pH6.0)。
(2)操作
①取新鲜幼嫩的植物材料1～5g,剪成小块,立刻放入液氮中贮存,备用。
②研钵及杵用液氮预冷,取出冷冻材料,置研钵中加入液氮研至细粉状。
③加入研磨缓冲液(1g 材料加2mL),继续研磨,转入50mL 离心管中。
④加入约一倍体积的苯酚/氯仿/异戊醇,于冰上使粉末分散均匀,4℃、5000r/min 离心10min。
⑤上清液转至新离心管中,重复用苯酚/氯仿/异戊醇抽提3次。
⑥将上清液转入新离心管,加入4mol/L NaAc(pH6.0)至终浓度为0.2mol/L 混匀,然后加入2.5倍体积的冷的乙醇,混匀,4℃条件下 10000r/min 离心10min。小心去上清液,沉淀溶于较小体积的重蒸馏水中。
⑦加入4mol/L NaAc(pH6.0)至3.0mol/L,混匀,置冰上2～3h,然后4℃条件下 10000r/min 离心10～30min。沉淀溶于20～1000μL 的0.2mol/L的 NaAc 中,加入2.5倍体积冷乙醇,4℃、10000r/min 离心10min。
⑧用70%乙醇洗沉淀,真空干燥,溶于 100L 水中,贮于-70℃或液氮中。
(3)说明该方法简单、经济,被认为是通用的方法。
3、LiCl沉淀法
(1)试剂
①提取缓冲液:100mmol/L LiCl,100mmol/L Tris·Cl(pH8.0),10mmol/L EDTA,1% SDS。
②4mol/L 及 2mol/L LiCl。
③50mmol/L EDTA。
(2)操作
①根据实验需要,取0.1～15g 叶片或愈伤组织置液氮中冷冻,研磨成粉。
②加入3～5倍体积80℃预热的提取缓冲液,混匀。
③加入0.5～1倍体积的氯仿/异戊醇,混匀,4℃、10000离心力离心15min。
④取上相,重复氯仿/异戊醇抽提1次。
⑤取上相,加入1倍体积的4mol/L LiCl,混匀后于4℃沉淀过夜或-20℃放置 3h 以上,沉淀 RNA。
⑥12000离心力离心 30min,去上清液。
⑦沉淀重悬于 2mol/L LiCl 和 50mmol/L EDTA 中,12000离心力离心30min,收集 RNA 沉淀,70%乙醇漂洗,吹干,溶于适量无菌重蒸水中,备用。
(3)说明
①该方法叶片 RNA 的产量可达0.05mg/g,愈伤组织产量可达0.03mg/g。
②对于不同材料及 RNA 的不同用处,在此基本方法上可加以修改:对于鉴定转化材料的简单快速提取,可在提取液中加入饱和酚,省去氯仿/异戊醇重复抽提及 2mol/L LiCl 的再次沉淀。
对于富含多糖的植物材料,操作中可采用或合用以下方法去除多糖。
①提取缓冲液提取后,离心上相中加入1/3体积的 5mol/L KAc,冰浴中放置30min。将用 LiCl 得到的沉淀溶于适量蒸馏水,加入0.1倍体积的无水乙醇放置30min。10000离心力离心 10min,取上相,再用2倍体积的无水乙醇沉淀。
③也可使用适量的 3mol/L NaAc(pH5.2)悬浮沉淀,冰浴放置3～5min 后离心收集沉淀。必要时可重复1次。
对于富含多酚类物质的材料,提取缓冲液中可加入2%的 PVP 及 10mmol/L 的半胱氨酸。
首页
