微生物限度检查法
对于口服药及外用药,不必要求达到无菌状态,但要保证药物的卫生质量。这就要求进行微生物限度检查。微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。控制菌检查指大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌的检查。
微生物限度检查应在环境洁净度10000级下、局部洁净度100级的单向流空气区城内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作,防止再污染。单向流空气区域工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
(一)检查前的准备工作
1.培养基的制备 微生物限度检查所用的培养基很多,如营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基、改良马丁琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、酵母浸出粉葡萄糖琼脂培养基、胆盐乳糖培养基等,其配方和配制过程均需按《中国药典》规定的配方制备或者使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。配制后,应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
2.菌液的制备
(1)菌种:验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代(从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代),并采用适宜的菌种保藏技术,以保证试验菌株的生物学特性用作阳性对照的菌种有:大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]金黄色葡萄球菌(SapHylococcus aureus)[CMCC (B)26003]、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )[CMCC(B)63501]、白念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspergillus nige)[CMCC(F)98003]、乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphiB)[CMCC(B)50094]生孢梭菌(Clastridium sporogenes)[CMCC (B)64941]、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10104]。
(2)菌液制备:接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中;生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中,培养18~24时;接种白念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中,培养24~48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50-100CFU的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中,培养5～7天,加入3~5ml含0.05%(V/V)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱。然后,吸出孢子悬液(用管口带有薄的无菌棉花或纱布、能过滤菌丝的无菌毛细吸管)至无菌试管内,用含0.05%(V/V)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50-100CFU的孢子悬液。
3、稀释液的制备
(1)pH7.0无菌氯化钠-蛋白陈缓冲液:取磷酸二氢3.56g、磷酸氢二钠7.23g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.0g、加水1000ml,微温溶解,滤清,分装,灭菌。
(2)pH6.8无菌磷酸盐缓冲液、pH7.6无菌磷酸盐缓冲液:按《中国药典》附录配制。
如需要,可在上述稀释液灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。
(3)09%无菌氯化钠溶液:取氯化钠9.0g,加水溶解使成1000ml,过滤,分装,灭菌然后过滤,分装,灭菌。
稀释液配制后,应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
(二)方法验证试验
当建立药品的微生物限度检查法时,应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法和控制菌检查方法的验证,以确认所采用的方法适于该药品的细菌霉菌及酵母菌数的测定和控制菌的检查。若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时,计数方法应重新验证。供试品检查时,如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂,应证明其有效性验证及对微生物的生长和存活无影响。
验证时,规定按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数及控制菌检查法所规定的方法及要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。依各品种项下微生物限度标准中检查的控制菌选择相应验证的菌株,验证大肠菌群检查法时,应采用大肠埃希菌作为验证菌株。
验证试验至少应进行3次独立的平行试验,并分别计算各试验菌每次试验的回收率。验证试验也可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查同时进行。
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