由于糖解作用的最后步骤是个难逆反应，因此在糖质新生的过程中，需要一个替代途径，才能将丙酮酸还原成磷酸烯醇丙酮酸。首先丙酮酸必需要先在丙酮酸羧化酶（Pyruvate carboxylase）的催化之下，消耗ATP分子并转变成草酰乙酸（Oxaloacetate）。
之后草酰乙酸又会经由磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶（Phosphoenolpyruvate carboxykinase）的催化，生成磷酸烯醇丙酮酸，在这个反应中，会消耗掉GTP，并生成GDP与二氧化碳。
与前后反应不同的是，以上的两个反应是在线粒体中进行。而且除了直接转变之外，草醋酸还可以利用另一个需要更多步骤的途径，来生成磷酸烯醇丙酮酸。此外，从磷酸烯醇丙酮酸的生成直到果糖-1,6-双磷酸产生为止，中间的糖质新生过程皆是糖解作用的逆反应。
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