siRNA表达载体构建好后，即可进行RNA干扰主体实验。
RNA干扰主体实验的重点在于：
成功将siRNA表达载体导入目的细胞
如果目的细胞的质粒转染效率较低（低于70%），则应采用腺病毒或慢病毒载体，利用病毒载体的高感染率、高表达特性，更好地开展RNA干扰主体实验。
设置好分组和对照
按照nature的标准，一个严格的RNAi介导knockdown实验要有6个对照：
1、转染试剂对照（监控转染及培养条件对结果的影响）；
2、nonsense siRNA对照（监控外源核酸本身对结果的影响）；
3、positive siRNA对照（监控假阴性）；
4、技术重复对照（也叫off-target 对照，也就是利用至少2个靶点的siRNA同时实验，2个siRNA互为off-target control，当两者的表型相同时，才有可能是特异性的knockdown效应）；
5、rescue 对照（knockdown之后做超表达，看是否有性状的逆转，这也是为了说明knockdown的特异性）；
6、全表达组扫描对照（就是转录/表达芯片扫描，以最终确定表型不是由于off-target造成）。
实际实验中，全表达组扫描对照很少有文献涉及。其它几个对照中，1、2两种对照即所谓的空白细胞对照、NC对照，基本是所有杂志都要求具备的。4、5两种对照，主要是为了解决off-target效应，选做一种即可，一般建议选5，涉及的实验即所谓的“RNA干扰回复实验”
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