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碱裂解法提取质粒dna的原理

2022.10.10
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碱裂解或碱提取是分子生物学中用于从细菌中分离质粒DNA的方法。

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方法

首先,含有感兴趣质粒的细菌被培养,随后通过离心浓缩细胞物质(包括DNA)至容器底部形成一个沉淀物。上清液被弃去,然后将沉淀物重新悬浮在含有EDTA的生理缓冲液中。EDTA的作用是与二价金属阳离子如镁离子和钙离子结合,这些离子对于DNA降解酶(DNases)的功能至关重要,同时也有助于稳定DNA磷酸基团骨架和细胞壁。缓冲液中的葡萄糖将维持细胞的渗透压,以防止细胞破裂。在缓冲液中加入三羟基尿素将保持细胞的pH值为8.0,而RNA酶将去除RNA,这将破坏实验。

此外,还准备了一种强碱性溶液,该溶液由洗涤剂十二烷基硫酸钠(SDS)和一种强碱如氢氧化钠(NaOH)组成,并随后加入。所得混合物经过几分钟的培养。在此期间,洗涤剂破坏细胞膜,使碱性物质能够接触并去折叠染色体和质粒DNA。在SDS撕裂细胞膜后,细胞内容物将中和氢氧化钠;这就是为什么溶解pH值从12.8降至12.3的原因。因此,若细菌细胞数量不足,多余的氢氧化钠将用于生成小的DNA片段。然而,0.5M L-精氨酸能够提供稳定的pH值,可用于替代0.1M的氢氧化钠。

最后,加入醋酸钾。此酸化溶液,使得质粒DNA得以再溶,但不包括染色体DNA,后者会从溶液中沉淀出来。钾的另一个功能是促使硫酸钠十二烷基磺酸盐的沉淀,从而去除洗涤剂。最终离心处理完成,这一次形成的沉淀物仅含有杂质,可被丢弃。含有质粒的上清液被小心地移除,可以进一步纯化或用于分析,如凝胶电泳。

其他用途

此外,有时还会使用碱性裂解法来提取植物遗传物质。植物细胞被置于一种强碱性溶液中,该溶液含有洗涤剂(通常为两性或非离子型洗涤剂,如Tween 20),然后在高温下进行培养。由于氢氧化钠对遗传物质的潜在损害性,使得该方法不常被采用,从而降低了DNA片段的大小。

碱裂解法提取质粒dna的原理是:高PH的溶液会使细胞壁粕类从而使得DNA和蛋白质变性。

将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中,会使细胞壁破裂,染色体DNA和蛋白质变性,将质粒DNA释放到上清中。

尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏,闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离,这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。只要用碱处理的强度和时间不要太过,当pH值恢复到中性时,DNA双链就会再次形成。

在裂解过程中,细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物,后者被十二烷基硫酸盐包盖。当用K+取代Na+时,复合物会从溶液中有效地沉淀下来,离心除去变性剂后,就可以从上清中回收复性的质粒DNA。

在SDS存在的条件下,碱水解是一项非常灵活的技术,它对E. coli的所有菌株都适用,并且其细菌培养物的体积可以从1-500mL以上。

碱裂解法适用于小量质粒DNA的提取,提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下:

1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2mlLB培养基。

2、37℃振荡培养过夜。

3、取1.5ml菌体于Ep管(离心管),以4000rpm离心3min,弃上清液。

4、加0.lml溶液I(1%葡萄糖,50mM/LEDTApH8.0,25mM/LTris-HClpH8.0)充分混合。

5、加入0.2ml溶液II(0.2mM/LNaOH,1%SDS),轻轻翻转混匀,置于冰浴5min。


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