小鼠ES细胞的分离方法基本成熟，且已广泛应用于生命科学研究的各个领域。1981年Evans首次分离得到小鼠ES细胞，他以手术切除受精后2.5 d小鼠卵巢并结合激素注射干扰子宫环境，从而使胚胎延迟着床，再回收胚胎，将其体外培养于STO细胞饲养层上，结果得到了小鼠ES细胞系。
Martin G R以免疫外科法剥离小鼠囊胚滋养层细胞，得到内细胞团(ICM)并将其置于STO细胞饲养层上，培养基为小鼠PSA-1 ES细胞条件培养基，结果也得到小鼠ES细胞。此后，Axelord等用微滴法得到小鼠ES细胞系；Kaufman等用单倍体延迟着床小鼠囊胚建立同源二倍体ES细胞系；Wobus等首次用原代小鼠成纤维细胞作饲养层建立了小鼠ES细胞系；Smith等首次使用大鼠肝细胞条件培养基作为分化抑制物建立了小鼠ES细胞系。Brook F A等进一步完善了小鼠ES细胞的分离方法，以致从许多品系小鼠包括近交系和突变系，都可获得ES细胞。
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