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聚合酶链反应的引物设计原则

2022.11.11
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zhaoqisun

致力于为分析测试行业奉献终身

PCR反应中有两条引物,即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准(常以信息链为基准),5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同;3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

(1)引物设计的基本原则

引物长度:15-30bp,常用为20bp左右。

引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。

引物内部不应出现互补序列。

两个引物之间不应存在互补序列,尤其是避免3 ′端的互补重叠。

引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%,引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列,否则易导致非特异性扩增。

引物3‘端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,最佳选择是G和C。

引物的5′端可以修饰。如附加限制酶位点,引入突变位点,用生物素、荧光物质、地高辛标记,加入其它短序列,包括起始密码子、终止密码子等。

(2)引物设计软件

Primer Premier5.0 (自动搜索)

vOligo6 (引物评价)

vVector NTI Suit

vDNAsis

vOmiga

vDNAstar

vPrimer3 (在线服务)


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