胚胎干细胞(ES细胞)是指从囊胚期的内细胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细胞,具有发育全能性,能进行体外培养<;扩增、转化和制作遗传突变型等遗传操作。本法以整合有外源基因的ES细胞作为供体细胞,大致过程如下:
(1)获取发育至一定时期的胚胎,经培养后,剥离和分散内细胞团,再培养,最后分离、扩散、鉴定ES细胞。
(2)通过基因打靶技术,将外源基因经逆转录病毒感染、电脉冲法等方法导入ES细胞,体外培养和筛选有外源基因表达者。
(3)获取囊胚期胚胎,作为ES细胞的移植受体。
(4)通过显微操作将ES细胞注入到囊胚期胚胎的腔内,使之与内细胞团紧靠在一起,成为嵌合体。
(5)将注射过的胚胎,经培养后筛选无发育缺损的囊胚,移植到交配第3天的假孕受体动物子宫内,培育出转基因动物。本法外源基因整合率高,植入囊胚前筛选合适的转化的ES细胞,克服了以前只能在子代选择的缺点,并能充分利用分子生物学发展起来的各种先进方法,是很有前途的技术。缺点是不易建立ES细胞系。并且由于通过嵌合体途径,所以实验周期长。