酪氨酸与色氨酸照高效液相色谱法(通则0512)测定供试品溶液精密量取本品3ml,置100m量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀。对照品溶液分别取酪氨酸对照品与色氨酸对照品适量,精密称定,加0.0 Imol/盐酸溶液使溶解并稀释制成毎lml中含酪氨酸0.175mg与色氨酸0.65mg的溶液,精密量取3ml,置50ml量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀。色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇水(10:90)(含0.008mol/L的磷酸二氢钾)为流动相;检测波长为280nm;进样体积20l系统适用性要求理论板数按色氨酸峰计算不低于4000,各峰间的分离度应符合要求测定法精密量取供试品溶液与对照品溶液,分别注人液相色谱仪,记录色谱图。按外标法以峰面积计算。半胱氨酸对照品溶液取半胱氨酸对照品适量,精密称定,加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含1mg的溶液。测定法精密量取本品与对照品溶液各1ml,分别置100ml量瓶中,各加甲酸1.5ml与30%过氧化氢溶液1ml,放置30分钟,用水稀释至刻度,摇匀,用适宜的氨基酸分析仪进行测定,计算。其他氨基酸采用适宜的氨基酸分析法或照高效液相色谱法(通则0512)测定。内标溶液取正亮氨酸适量,加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.8mg的溶液,摇匀供试品溶液精密量取本品3ml,置50ml量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,精密量取3ml,置10ml量瓶中,精密加入内标溶液2m1l,用水稀释至刻度,摇匀对照品溶液取异亮氨酸对照品约50mg、亮氨酸对照品约100mg、醋酸赖氨酸对照品约100mg、甲硫氨酸对照品约30mg、苯丙氨酸对照品约80mg、苏氨酸对照品约55mg、缬氨酸对照品约40mg、丙氨酸对照品约55mg、精氨酸对照品约70mg、门冬氨酸对照品约35mg、谷氨酸对照品约55mg、组氨酸对照品约50mg、脯氨酸对照品约30mg、丝氨酸对照品约mg与甘氨酸对照品约90mg,精密称定,置同一250ml量瓶中,加水适量使溶解并稀释至刻度,摇匀;精密量取5ml,置loml量瓶中,精密加入内标溶液2ml,用水稀释至刻度,摇匀。色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以lmol/L醋酸钠溶液(用稀醋酸调节pH值至6.5)-乙腈(93:7)为流动相A,以乙腈-水(80:20)为流动相B,进行梯度洗脱;柱温为40℃;检测波长为25nm;进样体积2pl时间(分钟)流动相A(%)流动相B(%)07232.035.01371145.00系统适用性要求各峰间的分离度应符合要求。测定法精密量取供试品溶液与对照品溶液各2ml,分别置20ml具塞试管中,精密加1mol/L三乙胺溶液-乙腈(14:86)lml,0.lmol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液1ml,摇匀,在50℃水浴中反应45分钟,取出,放冷,再分别精密加正己烷1ml,摇匀,放置30分钟后(溶液至澄清),取澄清的下层液,分别注入液相色谱仪,记录色谱图。按内标法以峰面积计算。
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