基因工程的载体和工具酶应用结合案例

第一节 载体

引 言

基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达，而目的基因本身无法进行复制和表达、不易进入受体细胞、不能稳定维持，所以就必须借助于“载体”及其“寄主细胞”来实现。

作为基因克隆的载体必须具备以下特性：

⑴载体必须是复制子。

⑵具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。

⑶具备多克隆位点（MCS），便于外源基因插入。

⑷自身分子量较小，拷贝数高。

⑸在宿主细胞内稳定性高。

一、质粒载体

（一）质粒的生物学特性

（1）质粒是独立于染色体以外的能自主复制的裸露的双链环状(少数为线形和RNA） DNA分子。

广泛从在于细菌细胞中，比病毒更简单。在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植物细胞中也发现了质粒，目前对细菌的质粒研究得比较深入，特别是大肠杆菌的质粒。大肠杆菌的质粒主要有F质粒（F因子）、R质粒（抗药性因子）和Col质粒（大肠杆菌素因子）三种。

（2）质粒的大小差异很大，最小的只有1kb,只能编码中等大小的2-3种蛋白质分子，最大的达到200kb。

（3）质粒的生存在寄主细胞中“友好”地“借居”，离开了寄主它本身无法复制；同时质粒往往有宿主专一性，如大肠杆菌的复制起点不一定能在其它生物细胞中繁殖。

（4）质粒的复制类型一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。据拷贝数将质粒分为两种复制型：“严紧型”质粒（stigent plasmid）,拷贝数为1-3；“松弛型”质粒（relaxed plasmid）,拷贝数为10-60。不过即使是同一质粒，其拷贝数在不同的寄主细胞间和不同的生长环境也可能有很大的变化。

（5）质粒的不亲和性 两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存。载体质粒与受体的质粒应是不同的不亲和群。

（6）质粒的转移

转移性质粒，含有tra基因；能通过结合作用从一个细胞转移到另一个细胞。

非转移性质粒，不含tra基因；可以为转移性质粒所带动转移。

（7）质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种。

（二）质粒DNA的制备

有多种分离质粒的方法，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。

目前一般使用碱变性法制备质粒DNA。这个方法主要包括培养收集细菌菌体，裂解细胞，将质粒DNA与染色体DNA分开及除去蛋白质和RNA。

1.碱变性法质粒提取的原理：

根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。

在pH值12.0～12.5范围内时，线性的DNA会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变性。

通过冷却或恢复中性pH值使之复性，线性染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒DNA。

2.碱变性法提取质粒的步骤：

（1）取1.5毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在微量离心管中，离心收集细胞沉淀；

（2）加入100微升冰冷的溶液I，（50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA）涡旋震荡悬浮菌液。

（3）加入200微升新配制的溶液II，（0.2M NaOH，1.0%SDS）缓缓混匀置室温5分钟。

（4）加入150毫升冰冷的溶液III，（醋酸钾29.4克，冰乙酸11.5毫升，加蒸馏水至100毫升）颠倒离心管10次后，冰浴5分钟。

（5）离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收集质粒DNA。

（三）质粒载体的改造

⑴去掉不必要的DNA区段。

⑵减少限制酶的识别位点，一种酶只保留一个。（单一的限制性酶切位点）。

⑶加入易于捡出的选择性标记基因。

⑷对质粒进行安全性改造，要求质粒不能随便 转移。

⑸改造或增加基因表达的调控序列。

1、质粒pBR322

结构：

（1）氨苄青霉素抗性基因（ampr或Apr）

内部有3种限制酶单一识别位点 。

（2）四环素抗性基因（tetr或Tcr）

内部有7种，启动区内有2种限制酶单一识别位点 。

（3）DNA复制起点（ori）

pBR322质粒的优点：

（1）具有较小的分子量。

4363bp，2.6×106Da，

（2）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。

（3）具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后,每个细胞中可累积1000～3000个拷贝。

（4）对多种常见的限制性内切核酸酶只含有一个能切割的位点。

2、pUC质粒载体

1987年，J.Messing和J.Vieria采用MCS技术在pBR322基础上构建的。

结构：

（1）来自于pBR322的Ori

（2）氨苄青霉素的抗性基因(ampr)。 但核苷酸序列发生了变化

（3） LacZ′基因

编码β—半乳糖酶的α—肽链即氨基末端。

（4）MCS区段

是一段用于插入外源DNA片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点在整个载体中是唯一的。

与pBR322相比， pUC质粒载体优点：

（1）具有更小的分子量和更高的拷贝数

如pUC8为2 750bp，pUCl8为2 686bp，控制质粒复制rop基因的缺失，平均每个细胞即可达500～700个拷贝

（2）适用于组织化学法检测重组体

通过a-互补作用，利用菌落颜色筛选重组子。

（3）具有多克隆位点区段（MCS）

可以定向克隆防止载体自我连接。

二、噬菌体载体

（一）l噬菌体载体

1. 噬菌体的生物学特性

烈性噬菌体：只具有溶菌生长周期

温和噬菌体：具有溶源生长周期和溶菌生长周期

溶菌周期指噬菌体将DNA注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。

溶源周期中，注入寄主细胞的噬菌体DNA是整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。

整合了一套完整的噬菌体基因组的细菌被称为溶源性细菌。在溶源性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体DNA被称为原噬菌体。

2. l噬菌体的生物学特性

⑴组成：蛋白质外壳和线状双链DNA分子组成。

lDNA长度为48502bp，在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端。当其注入到寄主细胞中后，可以迅速通过这两个粘性末端的互补作用形成双链的环形DNA分子。上述通过粘性末端互补形成的双链区被称为cos位点（cohesive end site）.

⑵是一个温和噬菌体

一般以溶源生长进行增殖，胁迫条件下也会进入溶菌生长周期。

⑶复制

溶源周期随溶源细菌染色体一起复制

溶菌周期的早期是“θ”复制，晚期进行滚环复制

⑷基因组成

lDNA至少包括61个基因，大多基因按功能相似性成簇排列，其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因，另一部分约1／3为非必须区段。

3. l噬菌体载体的类型

插入型 （Insertion vectors ）

这种载体仅仅有一个可供外源DNA插入的克隆位点。

如：λgt10 、 λgt11

克隆能力小，不到10kb

置换型 （Replacement vectors）

这种载体具有两个对应的酶切克隆位点，在两个位点之间的λDNA区段是λ噬菌体的非必需序列，可以被外源插入的DNA取代。

如Charon 4 载体

克隆能力大，20～25kb

（二）M13噬菌体

1、丝状噬菌体M13噬菌体的生物学特性

⑴是单链闭合环状噬菌体

只能感染雄性细菌，外形成丝状，基因组DNA长约6.4kb，可分为10个区和507 bp基因间隔区（IS区），该区可以接受外源DNA的插入而不会影响到噬菌体的活力。这是该噬菌体能用于单链DNA载体的重要前提。

⑵复制与增殖（图）

2. M13噬菌体载体的构建

⑴ 在IS区内插入LacZ基因 ⑵在标记基因区内组装MCS区段

所以能通过a互补在X-Gal/ IPTG平板上识别重组体。这类载体包括了 M13mp8、9 和 M13mp18 、 19等

这类载体的突出优点在于其既可以提供单链DNA，也可以提供双链的DNA。其最大的不足在于插入大的DNA片段后表现不稳定，在噬菌体增殖过程中容易发生缺失。所以一般克隆的片段在1kb之内，克隆300-400bp的片段十分稳定。

（三）柯斯质粒载体

1.柯斯质粒载体的特点

柯斯质粒是一类人工构建的含有lDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体，cosmid是cos site carrying plasmid的缩写。

柯斯质粒的大小为4-6kb，

由3部分组成：

A.多克隆位点区

B. 含有cos位点的lDNA区

C. 复制起始位点和抗性标记区

2.柯斯质粒载体的特性

1、具有l噬菌体的特性 柯斯质粒连接上适宜长度的外源DNA后可以在体外包装成噬菌体颗粒，并能高效转导寄主细胞。进入寄主细胞的DNA也能环化和复制，但是不会形成新的噬菌体颗粒，也不能发生溶菌现象。

2、具有质粒载体的特性 能象质粒一样在寄主细胞内复制，且带有抗性选择标记基因，有些还带有插入失活型的多克隆位点，为重组体的筛选提供了方便。

3、高容量的克隆能力 cos质粒本身很小，只有复制起点、选择标记和cos位点等构成，所以其克隆上限可达45kb左右。不过由于包装的限制，其克隆片段至少要达到30kb。

四种常用载体的比较

一、 限制性核酸内切酶及其应用

（一）限制性核酸内切酶的发现

当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。 EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。

最早分离出的限制内切酶是在1968年，Meselson和Yuan，大肠杆菌B和K菌株，EcoB和EcoK， 是I型的，没有实用价值。

首个II型限制内切酶是在1970年，由H.O.Smith等从Heamophilus influenzae的Rd菌株中Hind II 。使得DNA分子的体外精确切割成为可能。

从此，相关研究展开。如NEB公司的提取和克隆。目前已纯化出3000种限制性内切酶中，其中有30%是在NEB发现的 。

限制性核酸内切酶（restriction endonuclease ）：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。切开的是3，5－磷酸二酯键。

（二）限制性核酸内切酶的分类

分为I型、II型和III型。

（三）限制性核酸内切酶的命名

1、寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体

字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌Escherichia coli 表示为Eco , 流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示为Hin；

2、用一个正体字母表示菌株的类型，比如EcoR、Hind；

3、如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则用罗马数字标出，比如Eco R I、 Hind III。

（四） II型限制性核酸内切酶的基本特性

1、识别位点的特异性

每种酶都有其特定的DNA识别位点，通常是由4～8个核苷酸组成的特定序列（靶序列）。

2、识别序列的对称性

靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。

3、切割位点的规范性

交错切或对称切（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。

与II型核酸内切酶有关的几个概念

粘性末端：cohesive ends是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。

平 末 端 ：Blunt end在识别序列对称处同时切开DNA分子两条链，产生的平齐末端结构。则不易于重新环化。

同裂酶：isoschizomers 能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同来源的内切酶。不同同裂酶对位点的甲基化敏感性有差别。

同尾酶：isocaudamers 识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一类限制性核酸内切酶。如BamH I 、BclI、BglII和Xho I 是一组同尾酶。

注 意： 由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的任一种所识别。

（五）限制性核酸内切酶的消化反应

一个限制酶单位（U）指：在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为37℃）下，1h内中完全降解1 mg l DNA所需要的酶量。

影响酶活性的因素很多，最重要的有：

⑴　DNA的纯度

⑵　 DNA的甲基化程度

⑶　酶切反应的温度（通常为37℃ ）

⑷　DNA的分子结构

⑸　 核酸内切限制酶的缓冲液

在“非最适的”反应条件下,有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生“松动”，从其“正确”识别序列以外的其它位点切割DNA分子，这种现象叫星号活性。用*表示。

二、 DNA连接酶及其应用

（一）DNA连接酶的发现

环形DNA分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种切口的酶存在。

首个DNA连接酶(ligase)——大肠杆菌DNA连接酶，是1967年发现的，是大肠杆菌基因编码。

1970年，发现了T4DNA连接酶，由大肠杆菌T4噬菌体基因编码的。

（二） DNA连接酶作用特点

1. 连接的两条链必须分别具有自由3’－OH和5’－P，而且这两个基团彼此相邻；

2. 在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程。

E.coli DNA连接酶 －连接具互补碱基黏性末端(最初研究表明），现在研究可连接平末端；需NAD+辅助因子，活性低，不常用。

T 4DNA连接酶－连接具互补碱基黏性末端和平末端，需ATP辅助因子，活性高，常用。

（三） DNA连接酶的反应条件

影响连接效率的因素有：

1. 温度（通常在4-15℃ ）

2. ATP的浓度(10μM／L - 1mM／L )

3. 连接酶浓度（一般平末端大约需1～2U，黏性末端仅需0.1U）

4. 反应时间（通常连接过夜）

5. 插入片段和载体片段的摩尔比（ 1∶1～5∶1）

（四）T4 DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案

1．连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。

2．10μl体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1∶1～5∶1），补足ddH2O 至8μl。

3．轻轻混匀，稍加离心，56℃水浴5min后，迅速转入冰浴。

4．加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA连接酶合适单位， 用ddH2O 补至10μl，稍加离心，在适当温度（一般14-16℃）连接8-14hr。

三、DNA聚合酶及其应用

（一）大肠杆菌DNA聚合酶I

是Kornberg A. 1956年首先从大肠杆菌E。Coli 细胞中分离出来的。它是一种多功能性的酶，包括 3种不同的酶活力：

5′→ 3′聚合酶活性（模板， 带3′－OH游离基团的引物、4dNTPs、 Mg2+ ）。
双链特异性的5'→3'核酸外切酶活性。
3'→5'核酸外切酶活性。
从游离的双链或单链DNA的3′端降解。不过对于双链的降解可被5′-3′的多聚活性所抑制。主要是校正作用。

大肠杆菌DNA聚合酶I 的三种用途

1.利用缺口转移法制备高比活度的DNA探针

利用其5′--3′的外切酶活性及其聚合酶活性。

2.用于DNA连接前的大缺口填充

利用5′--3′的聚合酶活性。

3.用于DNA的序列分析

利用5′--3′的聚合酶活性。

（二）Klenow片段酶

Klenow片段是大肠杆菌聚合酶 I 全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子，分子量为76KD 。

酶催活性：⑴5’ →3’ 的聚合酶活性

　　　　　⑵3’ →5’ 的核酸外切酶活性

Klenow片段的主要用途（利用5’ →3’ 的聚合酶活性）：

⑴修补限制性酶消化DNA形成的3′隐蔽末端

⑵标记DNA片段的末端

底物用［α－32P］－dNTPs

⑶cDNA克隆中第二链cDNA的合成

⑷DNA序列的测定

（三）T4 DNA聚合酶

T4DNA聚合酶是从T4噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的，

1.酶催活性：

⑴5′→3′的聚合酶活性

⑵3 ′→ 5 ′的核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大肠杆菌聚合酶 I 的活性高200倍。比Klenow 片段酶强100～1,000倍。

因此，可以综合利用这两种活性进行取代合成反应：

如果反应体系中仅存在一种dNTP或没有底物时，这时T4DNA聚合酶就会表现出3 ′→ 5 ′外切酶活力，从双链DNA的3′开始降解，直到露出底物dNTP相同的碱基。然后就在此位置发生合成和取代反应。

2.T4DNA聚合酶的用途

(1)利用取代合成反应制备探针

(2)标记具有平末端的或具有3’－隐蔽末端的DNA片段

利用较强的3 ′→ 5 ′外切酶活性和 5′→3′聚合活性

(3)用于DNA序列分析

（四）逆转录酶（反转录酶）

逆转录酶 是一种依赖RNA的DNA聚合酶。

此酶首先是1970年从鼠白血病毒和劳氏肉瘤病毒中发现的。这两个课题组的论文都发在了同一期的《Nature》杂志上。

最普遍使用的是从鸟类骨髓母细胞瘤病毒（AMV）分离出来的。

活性：一种可以有效地将mRNA反转录成DNA的酶，其产物称为cDNA(complementary DNA).

主要用途是 将mRNA转录成cDNA以制备基因片段。

四、修饰性工具酶

（一）末端转移酶（terminal transferase）

l 末端转移酶是一类不依赖于DNA模板的DNA聚合酶。

l 特性：该类酶可以在没有模板链存在的情况下，将核苷酸连接到dsDNA或ssDNA的在3’－OH。特别是对于平末端的双链DNA末端加尾十分有用。

l 最常见的用途：给外源DNA片段及载体分子加上互补的同聚物尾巴，以创造黏性末端，便于重组。

（二） SI核酸酶（SI nuclease）

这是一种从米曲霉（Aspergillus oryzae）中分离的高度单链特异的外切酶。

活性：可以降解单链DNA或RNA或双链的单链区。

其主要用途有：

1. 在cDNA合成过程中，切开cDNA的发夹末端；

2. 载体构建过程中，切去DNA片段的单链尾巴，

形成平末端结构。

（三）碱性磷酸酶

从大肠杆菌中分离的细菌碱性磷酸酶（Bacterial Alkaline Phosphatase）简称BAP。

从小牛肠中分离的叫小牛肠碱性磷酸酶（ Calf Intestinal Alkaline Phosphatase） ，简称CIP，用的广泛。

酶催功能：

脱磷酸作用，将单链或双链DNA或RNA5’－P转化成5’－OH。

其主要用途有：

⑴在用32P标记DNA 5′端之前，去除5′端的磷；

⑵在DNA重组技术中，去除DNA片段的5′磷酸，防止载体的自身环化，提高重组子比例。